牛免疫球蛋白重鏈基因中JH，Eμ片段敲除的研究和JH，Cμ基因的分析.pdf

1、本實驗綜合基因小鼠抗體基因成功敲除的經驗和?？贵w重鏈基因的特點，選擇?？贵w重鏈基因中JH區(qū)的4，5，6外顯子及E μ片段作為目的基因，構建了基因敲除打靶載體。 根據已發(fā)表的?？贵w重鏈基因序列設計特異性引物，以Holstein牛肝臟基因組DNA為模板，擴增1.11kb(J)，3.63kb(M1)以及1.12kb(M2)片段。 以J片段作為短同源臂，M1、M2作為長同源臂，分別通過酶切位點Kpn Ⅰ-HindⅢ和EcoR Ⅰ

2、-EcoT22 Ⅰ定向克隆至載體pGTN29-TK，成功構建了能夠定點敲除牛JH區(qū)有功能外顯子及其3’端增強子序列的打靶載體pGTN29-TK-J-M2-M1，其中正篩選標記基因neo放在長臂與短臂之間，負篩選標記tk位于長臂外側。 為提高打靶效率，轉染前首先線性化打靶載體pGTN29-TK-J-M2-M1，通過脂質體和磷酸鈣法轉染牛胎兒成纖維細胞，用G418和GANC兩種藥物進行正負篩選，獲得123個抗藥性細胞克隆，挑選單克隆

3、擴大培養(yǎng)后，經微量PCR鑒定法證明獲得了6個陽性細胞克隆。 本實驗通過PCR、RT-PCR和Southern blot分析，證明序列號為AY158087和AY149283的兩個JH和序列號為AY230207和U63637的兩個Cμ基因以雙拷貝基因形式存在于?；蚪M中，它們都是功能基因，但表達水平相差懸殊，NCBIGeneBankTM上登錄的cDNA序列中主要表達AY158087 JH基因和AY230207 Cμ基因。進一步分析發(fā)