激光共聚焦內(nèi)鏡結(jié)合熒光標記的脂肪酸特異檢測大腸癌.pdf

1、研究背景：
　　代謝是生物體內(nèi)發(fā)生的用于維持細胞生長、增殖和分化等生命活動的反應(yīng)進程。多數(shù)腫瘤的代謝與正常細胞存在很大差異，正常細胞依賴葡萄糖有氧氧化、脂肪酸β氧化供能，而在腫瘤中，即使氧氣供給充足，腫瘤細胞很少進行葡萄糖有氧氧化過程，反之，其對外界葡萄糖的吸收大大增加且產(chǎn)生大量乳酸，這種以糖酵解為主的代謝方式也稱為“Warburg效應(yīng)”。
　　脂肪酸是機體許多器官的重要能量來源，可由食物供給和內(nèi)源性的合成產(chǎn)生，脂肪酸合成(

2、FASN)增加被稱為腫瘤代謝的另一重要標志，其與糖酵解過程密切相關(guān)。腫瘤細胞的脂肪酸代謝途徑異常，正常情況下，細胞吸收外源性的脂肪酸并將其轉(zhuǎn)化為甘油三酯，以提供機體的能量儲備。
　　結(jié)腸癌是發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，在全球女性癌癥相關(guān)死亡率中位居第三，男性中位居第四，2008年全球因結(jié)腸癌死亡人數(shù)為608，700，過去認為主要由基因突變所致，近年來，隨著環(huán)境改變和人們不均衡的膳食模式等原因，其發(fā)病率不斷增長，已成為我國發(fā)病率

3、升高最快的惡性腫瘤之一。腫瘤治療的關(guān)鍵在于早期發(fā)現(xiàn)，如果能在腫瘤發(fā)展早期作出相應(yīng)的判斷和檢測，50％以上的惡性腫瘤可以治愈，5年生存率可達80-90％。結(jié)腸癌早期因其組織的結(jié)構(gòu)和功能未出現(xiàn)明顯變化，診斷僅依賴臨床醫(yī)師的經(jīng)驗和腫瘤宏觀形態(tài)學、血清腫瘤標志物、影像學、病理學等手段，敏感度和特異度較低。內(nèi)鏡被認為是結(jié)腸癌早期診斷最有效的方式。普通內(nèi)鏡對早期胃腸癌的診斷率低，新興的內(nèi)鏡如染色內(nèi)鏡、放大內(nèi)鏡、超聲內(nèi)鏡等明顯提高了早期胃腸道腫瘤的檢

4、出率。
　　超聲內(nèi)鏡將內(nèi)鏡和超聲波結(jié)合于一體，行內(nèi)鏡檢查同時，使用超聲對待觀察部位進行定點探測，可知病變侵潤的深度、血管累及情況及與周圍臟器的關(guān)系。其在胰腺癌的診斷、胰腺假性囊腫穿刺治療方面有著其他內(nèi)鏡不可比擬的優(yōu)勢。
　　激光共聚焦內(nèi)鏡(CLE)是一種新型的內(nèi)鏡技術(shù)，它是傳統(tǒng)電子內(nèi)鏡和激光共聚焦顯微鏡整合的產(chǎn)物，在內(nèi)鏡檢查同時，還能進行共聚焦顯微鏡檢查，通過放大掃描檢查的組織1000倍，對細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)進行觀察，被稱為“

5、光學顯微鏡”。共聚焦內(nèi)鏡成像主要依靠熒光對比劑的存在，運用較多的為熒光素鈉和鹽酸吖啶黃，熒光素鈉是一種廉價、無致突變性的對比劑，靜脈注射熒光素鈉數(shù)十秒后，共聚焦內(nèi)鏡下即可清晰顯示細胞輪廓和排列方式，其成像范圍可從上皮表面深入至固有層，然而熒光素鈉并不富集于細胞核，不易觀察到細胞核形態(tài)，對病變的良惡性判別構(gòu)成很大干擾，且其可引起不良反應(yīng)如過敏反應(yīng)、惡心、嘔吐、眩暈等。
　　熒光基團標記的脂肪酸BODIPY-FA(C22H31BF2N

6、2O2)是天然脂肪酸的類似物，其分子量為404，具有親脂性，激發(fā)/發(fā)射波長為500/510nm能被488nm的氬離子激光器激活，目前主要運用在脂肪酸轉(zhuǎn)運的研究中，可于流式細胞儀及共聚焦顯微鏡下觀察。
　　研究目的：
　　在共聚焦內(nèi)鏡下，于不同腸癌模型的小鼠腸道局部給予BODIPY-FA染色，分析不同病變性質(zhì)的組織對BODIPY-FA的吸收情況，比較不同染色劑對于腫瘤診斷的效能，同時探討腸癌中脂肪酸吸收減少的相關(guān)機制。

7、　　研究方法：
　　1、流式細胞儀檢測BODIPY-FA在腸癌細胞株中的吸收曲線及其與硬脂酸的吸競爭抑制作用
　　(1)將不同的結(jié)腸癌細胞株以相同密度600，000個/孔培養(yǎng)于六孔板中，分別加入1ml的1uM BODIPY-FA工作液，恒溫箱內(nèi)放置10秒，30秒，1分鐘，2分鐘，5分鐘，10分鐘6個時間點，吸去BODIPY-FA，0度冰PBS終止反應(yīng)并清洗，經(jīng)消化、離心后，流式細胞儀檢測各時間點不同細胞對BODIPY-FA的

8、熒光吸收值。
　　(2)將不同的結(jié)腸癌細胞株以相同密度600，000個/孔培養(yǎng)于六孔板中，用1uM的BODIPY-FA工作液和濃度分別為0.15uM、1.5uM的硬脂酸混合液等體積混合，分別加入1ml上述不同混合液，無硬脂酸的為對照組，恒溫箱中放置10分鐘，0度冰PBS終止反應(yīng)并清洗，經(jīng)消化、離心后，流式細胞儀檢測各實驗組BODIPY-FA的熒光吸收值。
　　2、構(gòu)建動物模型
　　(1) AOM/DSS化學誘導(dǎo)結(jié)腸癌模

9、型
　　選取年齡為6周的Balb/c雄鼠，腹腔注射AOM12.5mg/kg后，正常飲水7天，于第2周予3％DSS連續(xù)7天，然后正常飲水連續(xù)14天，此為一個循環(huán)，即連續(xù)給予3％DSS7天，而后休息14天，總共三個循環(huán)。最后一個循環(huán)結(jié)束建模完成，不再給予DSS，我們前期的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):癌變的腸段（多靠近直腸）可出現(xiàn)肉眼可見的腸壁增厚、僵硬，能較好的提示腫瘤所在位置并進行染色處理。分批次提取老鼠，可直接處死小鼠進行組織染色的觀察和切片，

10、也可進行后續(xù)的活體實驗。
　　(2) APC-min小鼠
　　年齡為6-7周的APC-mm雄鼠購自南京大學模式動物中心，為自發(fā)的腸道腺瘤模型，購買6-8周雌鼠與之交配，待繁殖數(shù)量較多的小鼠并DNA鑒定后，可直接處死小鼠進行組織染色的觀察和切片，也可進行后續(xù)的活體實驗。
　　(3)裸鼠腸道移植瘤模型
　　選取年齡為6周的Balb/c裸鼠。取處于對數(shù)期生長期的腸癌細胞株LOVO大批量傳代，經(jīng)消化、計數(shù)、離心后，棄上清

11、收集細胞沉淀。在嚴格無菌條件下，以外科手術(shù)方式，用29g的微型注射器將細胞沉淀（每次細胞個數(shù)約106）注射入結(jié)腸漿膜層，注射成功的漿膜層可見局部圓形白色的隆起，有時可沿管壁呈縱形。關(guān)閉腹腔，表面消毒。約3-4周后移植的LOVO可突破肌層到達粘膜下層甚至粘膜層。
　　3、動物實驗（實驗過程避光進行）
　　(1)將腸癌模型的小鼠禁食12小時，以保證腸道清潔，用戊巴比妥0.01g/ml，劑量為6-7ul/g小鼠體重，腹腔注射麻醉，

12、采用外科手術(shù)方式暴露腹腔，間斷分離2段長約1cm的結(jié)腸，以手術(shù)縫線結(jié)扎腸段兩端，結(jié)扎程度松緊適宜，以熒光染料不能通過結(jié)扎口，又不影響腸管血運為佳。用注射器吸取100ul的染色劑注射入結(jié)扎好的腸段內(nèi)，小鼠分3組，染色劑分別為200uMBODIPY-FA、0.02％吖啶黃、500uM2-NBDG。10分鐘后拆除縫線并沖洗，可將染色部分的腸管剪取行快速冰凍切片，也可運用共聚焦內(nèi)鏡在體觀察。
　　(2)將共聚焦內(nèi)鏡的激光能量和亮度固定，于

13、上述小鼠熒光劑局部染色10分鐘后，將染色部位沖洗干凈，共聚焦內(nèi)鏡探頭與腸粘膜層緊密接觸，每個部位觀察時間不超過20秒。內(nèi)鏡醫(yī)師根據(jù)共聚焦成像判斷探測部位的性質(zhì)，實驗者用29g注射器（吸取印度墨汁）準確標記經(jīng)內(nèi)鏡醫(yī)師判斷過的病變部位。標號后的組織冰凍切片，HE金標準結(jié)果和共聚焦內(nèi)鏡診斷一一對應(yīng)。
　　研究結(jié)果：
　　1、BODIPY-FA在腸癌細胞內(nèi)的吸收及與硬脂酸競爭情況
　　不同細胞株對BODIPY-FA的吸收存在差

14、異，SW480對BODIPY-FA的吸收量最多，而LOVO和HCT116對其吸收相對較少。在10分鐘內(nèi)，SW480、LOVO、HCT116細胞吸收BODIPY-FA呈不斷增長曲線提示其在細胞內(nèi)不斷蓄積，而HT29在10分鐘可見下降趨勢。此實驗探索了貼壁細胞對BODIPY-FA染色的最佳時間，為后續(xù)的動物在體染色實驗提供參照。
　　在BODIPY-FA與硬脂酸(C18∶0)的吸收競爭實驗中，濃度為0.15uM和1.5uM的硬脂酸能不

15、同程度的抑制細胞對BODIPY-FA的吸收，這種抑制效應(yīng)在SW480中最為顯著。實驗證明BODIPY-FA與硬脂酸共同競爭細胞膜上的脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白，其為脂肪酸的類似物，可作為游離脂肪酸的替代物進行生物體內(nèi)代謝情況的研究。
　　2、Caveolin-1和CD36在人結(jié)腸癌組織中表達降低
　　熒光定量PCR檢測配對的人結(jié)腸癌患者正常和腫瘤組織中mRNA的表達。CD36mRNA在腫瘤組織中表達量顯著低于正常黏膜。caveolin-

16、1 mRNA在腸癌組織中表達量較正常組織降低（腫瘤:0.1031±0.04203，正常:0.4381±0.1129，P＜0.005)。余FABPpm、FATP4mRNA在腫瘤和正常組織中表達無明顯差異。
　　免疫組化檢測人結(jié)腸癌配對標本中Caveolin-1和CD36的蛋白表達情況，結(jié)果示:Caveolin-1主要于胞膜和胞漿中表達，在血管和基質(zhì)細胞內(nèi)也可檢測到表達，Caveolin-1于腫瘤中的表達較正常組織明顯降低，P=0.0

17、024。
　　研究結(jié)論：
　　通過上述實驗結(jié)果，我們得出以下結(jié)論:
　　1、BODIPY-FA為脂肪酸的類似物，在短時間內(nèi)可于細胞內(nèi)不斷蓄積。
　　2、相比其他對比劑，BODIPY-FA通過相對“暗區(qū)”特異地顯示腫瘤位置，具有高特異性。
　　3、BODIPY-FA染色后能夠?qū)λ∽冞M行細胞、亞細胞水平的描述，成像清晰，辨析度高。
　　4、在活體共聚焦使用中僅需局部染色，無毒性反應(yīng)，方法快速、安全、便捷

18、。
　　5、人結(jié)腸癌組織中Caveolin-1和CD36的mRNA和蛋白表達顯著降低，腫瘤對BODIPY-FA的吸收減少可能基于此原因。
　　我們通過構(gòu)建小鼠腸癌模型并在體實驗發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織對于BODIPY-FA的吸收明顯減少，其分子機制可能與Caveolin-1和CD36低表達相關(guān)，同時BODIPY-FA與共聚焦內(nèi)鏡的結(jié)合實現(xiàn)了腫瘤特異示蹤及細胞內(nèi)成像，有助于病變的實時定位、定性。本研究為臨床實踐及科研工作提供了發(fā)現(xiàn)早期腫