豬瘟和豬水泡病基因標(biāo)記疫苗的研究.pdf

1、本研究通過RT-PCR、套式PCR和亞克隆技術(shù)構(gòu)建了豬水泡病基因疫苗、豬水泡病和豬瘟二聯(lián)基因疫苗和幾種豬瘟基因疫苗，研究其免疫效果，為最終研制成功豬瘟和豬水泡病基因疫苗作技術(shù)探索。 1)構(gòu)建了幾種豬瘟基因疫苗：包括E2基因單表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNAEs1-11、E2基因雙抗原表達(dá)質(zhì)粒pBudCEEs1-11/Es2-22、E2基因與報告基因lacZ共表達(dá)質(zhì)粒pBudCElacZ/Es2-22、E2基因與豬IFN-γ基因共表達(dá)質(zhì)粒p

2、BudCEEs1-11/IFN-γ、以及E2基因與豬IL-18基因共表達(dá)質(zhì)粒pBudCEEs1-11/IL-18，將以上真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，用原位染色、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)或RT-PCR技術(shù)證實它們均可表達(dá)外源基因。 2)用這幾種豬瘟基因疫苗免疫兔，以阻斷ELISA和MTT法監(jiān)測試驗兔抗體水平和淋巴細(xì)胞增殖情況，并進行攻毒保護試驗。結(jié)果，單表達(dá)質(zhì)粒pcDNAEs1-11免疫組中有3/4兔產(chǎn)生E2抗體，

3、攻毒后，4/4完全保護。雙抗原表達(dá)質(zhì)粒pBudCEEs1-11/Es2-22免疫組有1/4兔產(chǎn)生抗體，攻毒后，1/4完全保護，1/4部分保護，2/4不保護。pBudCEEs1-11/IL-18和pBudCEEs1-11/IFN-γ免疫組，都未檢測到豬瘟抗體(4/4)，攻毒后，1/4部分保護，3/4不保護。pBudCElacZ/Es2-22免疫組(3只)也沒出現(xiàn)豬瘟抗體，攻毒后，3/3部分保護。而空載體pcDNA3.1和pBudCE4.1

4、對照組，4/4血清陰性，攻毒后，全部發(fā)病。與對照組相比，各免疫組的淋巴細(xì)胞均有一定程度的增殖。 3)構(gòu)建了豬水泡病和豬瘟二聯(lián)基因疫苗pBudCEE2/P1-11，用它轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，以間接免疫熒光染色和ELISA分別檢測到豬水泡病和豬瘟抗原的表達(dá)。將其免疫兔，可檢測到免疫組兔T淋巴細(xì)胞增殖明顯；但用阻斷ELISA未檢測到血清CSFV特異性抗體，用豬瘟活疫苗(Ⅱ)攻擊，實驗兔有1/4完全保護。用乳鼠中和試驗檢測，發(fā)現(xiàn)所有兔血

5、清SVDV中和抗體均低于1∶4。4)構(gòu)建了豬水泡病基因疫苗pcDNAP1，將其轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞經(jīng)熒光染色，可見許多特異性熒光細(xì)胞。用其單獨(B組)免疫或與pcDNAIFN-γ共同(C組)免疫豬三次，檢測免疫前、后豬血清中SVDV特異性抗體的變化，發(fā)現(xiàn)免疫后B組和C組各有兩只豬產(chǎn)生低水平的抗體，并在攻毒后迅速升高；并對免疫前和攻毒前的豬血清用乳鼠中和試驗檢測SVDV特異性抗體，結(jié)果只有pcDNAP1與pcDNAIFN-γ共同免疫細(xì)中

6、有兩只豬產(chǎn)生低水平的中和抗體(1∶4)，其余豬的中和抗體均小于1∶4。第三次免疫3月后，用豬水泡病香港乳鼠組織毒5mL(2mL蹄叉和3mL頸部肌肉)分兩個滴度(104LD50/0.1mL和105LD50/0.1mL)攻擊，結(jié)果pcDNAP1單獨免疫組(B組)有1/4獲得完全保護(為104/0.1mL攻擊)，pcDNAP1與pcDNAIFN-γ共同免疫組(C組)中有1/4獲得部分保護(為105/0.1mL攻擊)，A和D兩個對照組全部發(fā)病。