中藥疫苗稀釋劑提高豬偽狂犬和豬瘟弱毒疫苗的免疫效果研究.pdf

1、傳染病是威脅養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的危害因素之一。偽狂犬病(Pseudorabies，Pr)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PrV))引起的一種高度接觸性動(dòng)物傳染病。Pr對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害很大，15日齡以內(nèi)仔豬感染后死亡率高達(dá)100％，斷奶仔豬發(fā)病后死亡率約10～20％。豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的另一種烈性傳染

2、病，對(duì)中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前中國(guó)廣泛采用弱毒疫苗接種的方法來控制Pr和CSF，疫苗使用前一般須要經(jīng)過生理鹽水稀釋才能注射動(dòng)物。但在很多情況下疫苗不能有效地激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生理想的免疫應(yīng)答而導(dǎo)致免疫失敗。因此，本論文擬研究具有免疫增強(qiáng)作用的疫苗稀釋劑以提高偽狂犬弱毒(attenuated pseudorabies virus，aPrV)疫苗和豬瘟弱毒疫苗的免疫效果，為臨床應(yīng)用提供參考。
　　1.疫苗稀釋劑配方的研究
　　目

3、的:篩選合適的aPrV疫苗免疫增強(qiáng)劑配方。方法:以ICR小鼠為模型，免疫aPrV疫苗，以血清特異性PrV gB抗體為指標(biāo)，評(píng)價(jià)白術(shù)多糖（RAMPS）和人參莖葉皂苷(GSLS)的免疫增強(qiáng)作用;以血清PrV gB、PrV gB IgG1、PrV gB IgG2a和攻毒保護(hù)為指標(biāo)，評(píng)價(jià)候選稀釋劑配方的免疫增強(qiáng)效果。結(jié)果:GSLS、RAMPS和硫柳汞(TS)均能增強(qiáng)小鼠血清PrV gB抗體水平，以GSLS的免疫增強(qiáng)作用最好。GSLS聯(lián)合RAMP

4、S沒有協(xié)同作用，GSLS聯(lián)合TS表現(xiàn)出協(xié)同作用，以GSLS-TS（6μg-1μg）的免疫增強(qiáng)效果最為顯著。該配方能提前促進(jìn)血清PrV gB、PrV gB IgG1和PrV gB IgG2a抗體的產(chǎn)生，并能在較長(zhǎng)時(shí)間維持抗體在較高水平。偽狂犬野毒攻毒后，含GSLS-TS的稀釋劑疫苗組小鼠的存活率明顯高于生理鹽水稀釋疫苗組（70％vs40％）。
　　2.滅菌方法和貯存條件對(duì)GSLS-TS免疫活性的影響
　　目的:觀察滅菌方法和貯

5、存條件對(duì)GSLS-TS免疫增強(qiáng)作用的影響。方法:以ICR小鼠為模型，分別用不同滅菌方法處理的GSLS溶液和不同貯存條件下保存1年的GSLS-TS溶液稀釋aPrV疫苗后免疫小鼠，以血清特異性抗體水平為指標(biāo)，評(píng)價(jià)滅菌方法和貯存條件對(duì)GSLS-TS免疫增強(qiáng)作用的影響。結(jié)果:高溫(100～121℃)處理和光照均會(huì)顯著降低GSLS-TS的免疫增強(qiáng)效果。因此，GSLS-TS溶液不宜高溫滅菌，并適合在低溫避光條件下保存。
　　3.GSLS-TS

6、和其它6種商品稀釋劑佐劑作用的比較
　　目的:將GSLS-TS溶液與6個(gè)廠家的aPrV疫苗專用稀釋劑進(jìn)行效果對(duì)比。方法:以ICR小鼠為模型，周GSLS-TS溶液稀釋6個(gè)不同廠家的aPrV疫苗，并與它們各自的專用疫苗稀釋劑和生理鹽水進(jìn)行對(duì)比，以血清特異性抗體水平為指標(biāo)。結(jié)果:除“晶制”廠家的稀釋劑外，其它廠家的疫苗稀釋劑免疫增強(qiáng)作用不明顯，與生理鹽水相比沒有顯著的差異。GSLS-TS溶液的免疫增強(qiáng)作用顯著優(yōu)于生理鹽水和6種專用疫苗稀

7、釋劑。
　　4.GSLS-TS提高豬對(duì)Pr和CSF弱毒疫苗的抗體反應(yīng)研究
　　目的:通過本動(dòng)物試驗(yàn)觀察GSLS-TS對(duì)豬弱毒疫苗的免疫增強(qiáng)作用。方法:用GSLS-TS溶液分別稀釋Pr和CSF弱毒疫苗后免疫豬，以血清特異性抗體水平為指標(biāo)，評(píng)價(jià)GSLS-TS對(duì)疫苗誘導(dǎo)體液免疫的影響。結(jié)果:GSLS-TS能同時(shí)促進(jìn)豬對(duì)Pr和CSF兩種弱毒疫苗的體液免疫反應(yīng)，顯著促進(jìn)血清特異性抗體、抗體亞類和中和抗體滴度。
　　5.GSLS-

8、TS對(duì)細(xì)胞免疫的影響
　　目的:評(píng)價(jià)GSLS-TS對(duì)疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫的影響。方法:用GSLS-TS溶液稀釋aPrV疫苗后免疫小鼠，24h后檢測(cè)脾臟中NK細(xì)胞的殺傷活性、血清中IFN-γ水平;二免二周時(shí)，檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖活性和淋巴細(xì)胞中Th1和Th2類細(xì)胞因子分泌。結(jié)果:GSLS-TS能快速促進(jìn)疫苗誘導(dǎo)的機(jī)體早期免疫反應(yīng)（NK細(xì)胞殺傷活性、血清IFN-γ產(chǎn)生），顯著增強(qiáng)脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性，提高淋巴細(xì)胞分泌Th1（IFN-γ、I

9、L-12）和Th2(IL-5、IL-10)類細(xì)胞因子水平。
　　6.GSLS-TS免疫增強(qiáng)作用機(jī)制研究
　　目的:初步探討GSLS-TS免疫增強(qiáng)作用的機(jī)制。方法:將GSLS和（或）TS與小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7共孵育，以miR-132、miR-146a、miR-147和miR-155的mRNA表達(dá)為指標(biāo)，分析GSLS或（和）TS對(duì)RAW264.7細(xì)胞中這4種miRs水平的影響;給ICR和C3H/HeJ小鼠免疫aPrV疫

10、苗，以血清特異性抗體、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)以及淋巴細(xì)胞表達(dá)Th1和Th2類細(xì)胞因子mRNA的水平為指標(biāo)，初步分析GSLS-TS免疫增強(qiáng)作用與TLR4的關(guān)系。結(jié)果:用GSLS或（和）TS與RAW264.7細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)能顯著提高細(xì)胞中miR-132、miR-146a、miR-147和miR-155的mRNA表達(dá)，而且GSLS和TS表現(xiàn)出協(xié)同作用;GSLS-TS能同時(shí)提高ICR小鼠和C3H/HeJ小鼠免疫aPrV疫苗后血清特異性抗體反應(yīng)，同時(shí)增

11、強(qiáng)Con A和PrV抗原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖活性以及淋巴細(xì)胞表達(dá)Th1(IFN-γ、IL-12)和Th2(IL-5、IL-10)類細(xì)胞因子的mRNA水平，說明GSLS-TS的免疫增強(qiáng)作用不主要與TLR4相關(guān)。
　　綜上所述，GSLS和TS對(duì)aPrV疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)具有協(xié)同增強(qiáng)作用，GSLS-TS可顯著增強(qiáng)aPrV免疫小鼠早期免疫反應(yīng)、體液免疫反應(yīng)、細(xì)胞免疫反應(yīng)以及對(duì)野毒攻毒的抵抗力。本動(dòng)物試驗(yàn)表明，稀釋劑能顯著增強(qiáng)豬對(duì)Pr和CSF