大鼠背根神經(jīng)節(jié)膜聯(lián)蛋白A2和β5微管蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、研究背景：
　　 神經(jīng)病理性疼痛是神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的一種慢性狀態(tài)，嚴(yán)重困擾人類的健康。背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia， DRG)作為痛覺傳入的第一級(jí)神經(jīng)元，在神經(jīng)病理性疼痛的外周機(jī)制中起著重要作用。目前有研究表明細(xì)胞骨架及其相關(guān)蛋白如膜聯(lián)蛋白A2（annexinⅡ，annexin A2）和β5微管蛋白(tubulin beta-5/beta5-tubulin)與DRG傷害性感受傳導(dǎo)過程關(guān)系密切，但分子機(jī)制尚不

2、明確。本實(shí)驗(yàn)利用基因工程的技術(shù)，提取大鼠DRG中annexinⅡ的基因Anxa2和tubulin beta-5的基因Tubb5，構(gòu)建其真核表達(dá)載體，并對(duì)其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)作初步鑒定，以期為深入研究annexinⅡ和tubulin beta-5在調(diào)控DRG傷害性感受傳導(dǎo)過程中的分子機(jī)制及明確與其相互作用的蛋白奠定基礎(chǔ)。
　　 研究目的：
　　 克隆大鼠背根神經(jīng)節(jié)annexinⅡ和tubulin beta-5的基因，構(gòu)

3、建真核表達(dá)載體并檢測(cè)其表達(dá)。
　　 研究方法：
　　 提取大鼠腰部背根神經(jīng)節(jié)組織總RNA，RT-PCR法擴(kuò)增大鼠DRG細(xì)胞中annexinⅡ的基因Anxa2和tubulin beta-5的基因Tubb5，分別構(gòu)建pGMT-Anxa2和 pGMT-Tubb5克隆載體。以此為模板，設(shè)計(jì)含有flag標(biāo)簽序列的引物序列，上下游分別插入HindⅢ、NotⅠ酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增Anxa2-flag和Tubb5-flag序列，并與pc

4、DNA3.1(+)空載體行連接轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，在Amp瓊脂平板上挑選克隆。抽提質(zhì)粒后行PCR及酶切鑒定，鑒定為陽性克隆者用T7、BGH引物對(duì)其進(jìn)行全序列測(cè)定分析。從而獲得表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag和pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag。采用Lipo2000脂質(zhì)體法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到六孔板培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞中，設(shè)表達(dá)載體組、pcDNA3.1(+)空載體對(duì)照組和空轉(zhuǎn)HEK293細(xì)胞的陰性對(duì)照組。

5、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)需事先制成細(xì)胞爬片，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后分別以小鼠源性anti-flag抗體(1:200)、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1:200)孵育，DAPI染核、封片后于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并照相。FITC激發(fā)后可產(chǎn)生綠色熒光，指示目的蛋白annexinⅡ或tubulin beta-5的分布；DAPI激發(fā)后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光，指示細(xì)胞核的分布。六孔板（未置爬片）細(xì)胞轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，收集細(xì)胞提取蛋白。以小鼠源性anti-flag

6、抗體為一抗(1:500)、辣根過氧化物標(biāo)記的IgG-HRP為二抗(1:5000)行Western blot法檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1．PCR擴(kuò)增Anxa2/Tubb5的mRNA編碼序列：Anxa2和Tubb5大小分別為1020bp和1335bp。行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果可見Anxa2樣品條帶約為1000bp左右，Tubb5樣品條帶約為1300bp左右，與預(yù)期結(jié)果相同，PCR擴(kuò)增成功。
　　 2．pGM

7、T-Anxa2/pGMT-Tubb5克隆載體鑒定：pGMT-Anxa2/pGMT-Tubb5質(zhì)粒樣品行1％瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下觀看均有亮帶，示有質(zhì)粒提出；選取最亮條帶的質(zhì)粒樣品行序列測(cè)定，結(jié)果示克隆載體pGMT-Anxa2/pGMT-Tubb5構(gòu)建正確。
　　 3．PCR擴(kuò)增出Anxa2-flag和Tubb5-flag片段：Anxa2-flag和Tubb5-flag的大小分別為1044bp和1359bp。行1％瓊脂糖凝膠電泳

8、，可見Anxa2-flag條帶在1000-1100bp之間，Tubb5-flag條帶在1300-1400bp之間，與預(yù)期結(jié)果相同，PCR擴(kuò)增成功。
　　 4．重組質(zhì)粒的鑒定：以重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag和pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag為模板行PCR，產(chǎn)生約為1044bp和1359bp的條帶；質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和NotⅠ雙酶切鑒定，可分別切開約為1044bp和1359bp的小片段；酶切鑒定正確

9、者行序列測(cè)定，結(jié)果示重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag和pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag構(gòu)建成功。
　　 5．細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)目的蛋白及細(xì)胞內(nèi)定位：pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag組FITC激發(fā)后產(chǎn)生綠色熒光，指示目的蛋白annexinⅡ有穩(wěn)定表達(dá)，并且廣泛均勻分布于胞質(zhì)和胞膜；pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag組，F(xiàn)ITC激發(fā)后亦有綠色熒光，廣泛分布于胞質(zhì)和胞膜，指示目的蛋白

10、tubulin beta-5表達(dá)。兩組實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體組和陰性對(duì)照組的HEK293細(xì)胞內(nèi)均未檢測(cè)到標(biāo)記目的蛋白熒光信號(hào)。
　　 6．Western blot法檢測(cè)annexinⅡ蛋白和tubulin beta-5蛋白的表達(dá)：pCDNA3.1(+)-Anxa2-flag和pCDNA3.1(+)-Tubb5-flag表達(dá)載體組分別在相對(duì)分子質(zhì)量約為36KD、50KD處出現(xiàn)單一蛋白條帶，pcDNA3.1(+)空載