糖尿病大鼠治療后膀胱和腰骶背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)生長因子的表達(dá).pdf

1、目的:通過研究神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)和胰島素對糖尿病大鼠膀胱和腰骶背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)中NGF表達(dá)情況的影響,分析糖尿病膀胱病變(diabetic cystopathy,DC)的發(fā)病機(jī)制及NGF和胰島素的治療作用,為在血糖有效控制的情況下應(yīng)用NGF治療DC提供充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 成年雄性Wistar大鼠35只,體重180～2

2、20g,隨機(jī)選取7只大鼠,腹腔注射50mg/kg的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液作為正常對照組(NC組),分別在1、4和8周時(shí)測尾靜脈血葡萄糖濃度(blood glucose,BG),以排除糖尿病大鼠(BG＞16.7mmol/L)。參照Schmeichel等方法,將剩余的大鼠在造模前一天晚禁食不禁水12小時(shí),然后一次性腹腔注射1％的鏈脲佐菌素(50mg/kg,0.1mol/L的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液配制而成,PH4.2～4.5)誘發(fā)糖尿病,注射

3、STZ72小時(shí)后用血糖儀測尾靜脈血葡萄糖濃度。BG＞16.7mmol/L者確定為糖尿病大鼠模型成功。結(jié)果共有26只大鼠造模成功。大鼠造模成功后給予普通飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)食飲水。飼養(yǎng)4周后剩余24只,將其隨機(jī)分成4組,即:DC組6只、DC單用NGF組(NGF組)6只、DC單用胰島素組(RI組)6只、DC聯(lián)合應(yīng)用NGF和胰島素組6只(NGF+RI組,胰島素通過頸部皮下注射給藥,NGF通過腹腔內(nèi)注射給藥)。將大鼠分別給予不同的處理:每天1次,共

4、4周。
　　 造模成功8周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),再次檢測除NC組外的各組大鼠尾靜脈血葡萄糖濃度,BGS≤16.7mmol/L者仍被排除。實(shí)驗(yàn)前1天將大鼠放入代謝籠測定24小時(shí)尿量。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天測大鼠體重,實(shí)驗(yàn)切取完整膀胱和兩側(cè)腰6骶1DRG,稱量膀胱濕重。并取每只大鼠的部分膀胱和一側(cè)腰6骶1DRG分別置于4％的戊二醛固定液中進(jìn)行電鏡觀察。將剩余的膀胱和腰6骶1DRG置于4％多聚甲醛溶液中固定,蘇木素-伊紅(HE)染色后,光鏡下觀察糖尿病大鼠膀

5、胱逼尿肌和腰6骶1DRG的形態(tài)學(xué)變化。采用免疫組織化學(xué)方法檢測膀胱逼尿肌細(xì)胞和腰6骶1DRG神經(jīng)元中NGF的表達(dá)情況。光鏡下觀察結(jié)果,膀胱逼尿肌細(xì)胞內(nèi)或腰6骶1DRG神經(jīng)元內(nèi)含有棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。以陽性細(xì)胞染色的平均光密度值(OD值)來表示NGF的表達(dá)量。通過Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)在相同的放大倍數(shù)下對免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析。在高倍視野(×200)下觀察,每張切片隨機(jī)取6個(gè)位置相應(yīng)、不重復(fù)的視野(每只大鼠取3

6、張切片,每張切片觀察2個(gè)高倍視野),取6個(gè)視野均值作為該片平均光密度值(OD值),每樣本兩張切片均值作為該樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±s)表示,兩兩均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)或t’檢驗(yàn),多個(gè)均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one wayanalysis of variance,one way ANOVA),并用Q檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較,使用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:設(shè)定P＞0.05為無顯

7、著性差異;P＜0.05表示差異具有顯著性;P＜0.01表示存在極顯著差異。
　　 結(jié)果:
　　 1：DC組與NC組體重、血糖、24小時(shí)尿量、膀胱濕重的比較造模成功8周后即治療4周后,DC組大鼠體重、血糖、24小時(shí)尿量、膀胱濕重與NC組相比分別為:(219.5±11.06g)vs(309.7±8.38g)(t=-16.73P＜0.01);(30.9±2.33mmol/L)vs(4.3±0.18mmol/L)(t=30.33

8、 P＜0.01);(90.63±5.00ml)vs(21.33±2.08m1)(t=33.65 P＜0.01);(171.97±4.32mg)vs(136.19±3.47mg)(t=16.57 P＜0.01)明顯高于NC組。
　　 2：透射電鏡結(jié)果正常對照組:逼尿肌細(xì)胞分布均勻,形態(tài)相似,走行整齊,細(xì)胞間連接緊密,胞飲小泡在肌質(zhì)膜下的分布較多,細(xì)胞內(nèi)線粒體大小形態(tài)正常,基質(zhì)密度正常,致密體分布均勻;腰6骶1DRG中神經(jīng)髓鞘均勻一

9、致,成同心圓形排列,胞漿均勻,神經(jīng)膠質(zhì)正常。
　　 實(shí)驗(yàn)組:逼尿肌細(xì)胞分布雜亂,形態(tài)多樣,走行紊亂,細(xì)胞之間的中間連接減少,常常被膠原纖維和無定形成分所填充,胞飲小泡在肌質(zhì)膜下的分布變少,細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹,嵴稀疏、斷裂、甚至消失,基質(zhì)密度降低,致密體分布雜亂;腰6骶1DRG中神經(jīng)髓鞘水腫、變性、斷裂、甚至脫落,神經(jīng)胞漿空泡變性,神經(jīng)膠質(zhì)空泡變性。以上表現(xiàn)在DC組表現(xiàn)最嚴(yán)重,在RI組和NGF組表現(xiàn)相對較輕,在NGF+RI組表現(xiàn)不明

10、顯,其與正常對照組表現(xiàn)較相似。
　　 3：免疫組化結(jié)果分析光鏡下觀察正常對照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠膀胱逼尿肌和腰6骶1DRG結(jié)構(gòu)表現(xiàn)。(1)正常對照組:HE染色可見橫行及縱行切斷的肌束排列整齊,結(jié)構(gòu)緊密,間隙充滿結(jié)締組織。固有膜完整,粘膜下及肌間神經(jīng)束多見。免疫組化染色可見逼尿肌細(xì)胞大小形態(tài)均勻一致,肌纖維排列整齊,細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密。神經(jīng)元細(xì)胞大小形態(tài)均勻一致,排列整齊,細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密。(2)實(shí)驗(yàn)組:HE染色可見逼尿肌肌束排列松散紊亂,肌

11、束間隙明顯增寬,間隙間并未被結(jié)締組織充滿,肌束間膠原纖維減少。肌束之間的小血管充血,可以看見神經(jīng)束。免疫組化染色可見逼尿肌細(xì)胞肥大,形態(tài)多樣,排列紊亂,細(xì)胞間結(jié)構(gòu)松散。神經(jīng)元細(xì)胞排列松散紊亂,細(xì)胞水腫且形態(tài)多樣,間質(zhì)增生,細(xì)胞間結(jié)構(gòu)松散。以上表現(xiàn)在DC組表現(xiàn)最嚴(yán)重,在RI組和NGF組表現(xiàn)相對較輕,在NGF+RI組表現(xiàn)不明顯,其與正常對照組表現(xiàn)較相似。
　　 4：NGF在膀胱壁中表達(dá)的比較采用SP免疫組織化學(xué)染色檢測NC組、DC組

12、、RI組、NGF組和NGF+RI組大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞中NGF的表達(dá)情況。光鏡下觀察結(jié)果,大鼠逼尿肌細(xì)胞內(nèi)含有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。糖尿病大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞中NGF的表達(dá)比正常對照組明顯減少;NGF組、NGF+RI組大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞中NGF的表達(dá)均明顯高于DC組(P＜0.05);同時(shí)NGF組、RI組與NGF+RI組之間NGF的表達(dá)均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 5：NGF在腰6骶1DRG神經(jīng)元中表達(dá)的比較采用SP免疫組

13、織化學(xué)染色檢測NC組、DC組、RI組、NGF組和NGF+RI組大鼠腰6骶1DRG神經(jīng)元中NGF的表達(dá)情況。光鏡下觀察結(jié)果,腰6骶1DRG神經(jīng)元中含有棕黃色顆粒為陽性。糖尿病大鼠腰6骶1DRG神經(jīng)元中NGF的表達(dá)比正常對照組明顯減少;NGF組、NGF+RI組大鼠腰6骶1DRG神經(jīng)元中NGF的表達(dá)均明顯高于DC組(P＜0.05);同時(shí)NGF組、RI組與NGF+RI組之間NGF的表達(dá)均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論: