小麥-葉銹菌互作過(guò)程中HR誘發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及Ca2+介導(dǎo)的基因表達(dá)分析.pdf

1、葉銹菌（Puccinia triticina）侵染引發(fā)的小麥（Triticum aestivum L.）葉銹病是一種常見(jiàn)的、廣泛的小麥病害，流行年份給小麥生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。寄主抗病機(jī)制的研究是控制這類(lèi)病害最經(jīng)濟(jì)、有效、可持續(xù)性和環(huán)保的方法。本課題組多年來(lái)從事小麥抵抗葉銹菌侵染的分子機(jī)制研究工作，小麥葉銹菌屬于專(zhuān)化性非常強(qiáng)的活體寄生真菌，在不親和組合中小麥通過(guò)過(guò)敏性反應(yīng)(hypersensitive reaction，HR)來(lái)抵抗葉銹菌的

2、侵染，過(guò)敏性反應(yīng)是指在葉銹菌侵染部位與吸器母細(xì)胞接觸的寄主細(xì)胞快速死亡，從而限制病原菌的繁殖和擴(kuò)展。為此，葉銹菌侵染誘發(fā)過(guò)敏性反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制一直是我們研究的重點(diǎn)。在前期工作的基礎(chǔ)上，本文通過(guò)激發(fā)子-懸浮細(xì)胞和葉銹菌-小麥兩個(gè)互作體系較為系統(tǒng)地探討了鈣離子和NO在寄主細(xì)胞表達(dá)過(guò)敏性反應(yīng)中的作用，以及Ca2+、NO和H2O2三者之間的關(guān)系;利用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)由鈣信號(hào)介導(dǎo)的基因表達(dá)進(jìn)行了分析。本文獲得的主要結(jié)果如下:
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3、、在激發(fā)子-懸浮細(xì)胞互作體系中，以感染葉銹菌的小麥葉片細(xì)胞間隙液IWF260作為激發(fā)子，刺激小麥品種‘洛夫林10’和‘鄭州5389’的懸浮細(xì)胞，探討由激發(fā)子引發(fā)懸浮細(xì)胞過(guò)敏性反應(yīng)中Ca2+和NO的變化及相互作用。以熒光分子探針Fluo-3AM和DAF-FM DA分別對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+和NO進(jìn)行標(biāo)記，利用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)對(duì)其動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，通過(guò)藥物學(xué)試驗(yàn)對(duì)Ca2+產(chǎn)生的機(jī)制及其與NO的關(guān)系進(jìn)行探討。結(jié)果表明:兩個(gè)小麥品

4、種懸浮細(xì)胞的[Ca2+]。yt水平對(duì)激發(fā)子刺激的反應(yīng)有著明顯的差異，對(duì)葉銹菌小種260表現(xiàn)不親和的‘洛夫林10’懸浮細(xì)胞在激發(fā)子刺激后330秒和700秒出現(xiàn)兩個(gè)鈣峰，而對(duì)該小種表現(xiàn)親和的‘鄭州5389’懸浮細(xì)胞在激發(fā)子刺激后[Ca2+]cyt水平稍有波動(dòng)但變化不明顯;藥物學(xué)試驗(yàn)證明，[Ca2+]cyt的升高依賴(lài)于胞外鈣離子內(nèi)流，鈣離子與激發(fā)子刺激誘發(fā)的過(guò)敏性防衛(wèi)反應(yīng)緊密相關(guān)。同樣，在激發(fā)子刺激后，‘洛夫林10’懸浮細(xì)胞出現(xiàn)一個(gè)NO峰，而

5、‘鄭州5389’懸浮細(xì)胞胞質(zhì)NO變化不明顯。藥物學(xué)試驗(yàn)初步證明，NO的產(chǎn)生與胞外鈣離子內(nèi)流密切相關(guān)。由此推測(cè)在小麥懸浮細(xì)胞應(yīng)答激發(fā)子刺激誘發(fā)的過(guò)敏性反應(yīng)中，NO可能在鈣的下游發(fā)揮作用。
　　2、在葉銹菌-小麥互作體系中，以小麥品種‘洛夫林10’與葉銹菌生理小種165和260分別組成親和與不親和組合，利用特異熒光分子探針DAF-FM DA對(duì)細(xì)胞內(nèi)的NO進(jìn)行標(biāo)記，并輔以激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)葉銹菌侵染引發(fā)的小麥防衛(wèi)反應(yīng)過(guò)程中NO的動(dòng)態(tài)

6、變化進(jìn)行觀察，通過(guò)酶活性的測(cè)定并借助藥物學(xué)試驗(yàn)對(duì)NO的產(chǎn)生機(jī)制及該互作過(guò)程中NO與H2O2和鈣信號(hào)之間的關(guān)系進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，不親和組合在接種后4h在菌侵染部位的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中有極微弱的綠色熒光出現(xiàn)，表明有很少的NO產(chǎn)生，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，在接種后12h鄰近氣孔的細(xì)胞中其N(xiāo)O熒光逐漸增強(qiáng)，NO的熒光面積也在不斷擴(kuò)大，在接種后24-72h綠色熒光主要集中在發(fā)生HR的細(xì)胞內(nèi);而親和組合只在接種后4h在菌接觸的氣孔處可觀察到少量綠色熒光

7、，而其后各時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有觀察到綠色熒光。酶活性的測(cè)定結(jié)果顯示，不親和組合較親和組合表現(xiàn)出較高的NOS和NR活性，初步表明不親和組合中NO的產(chǎn)生源于NOS和NR兩條酶促反應(yīng)途徑。酶抑制劑試驗(yàn)結(jié)果顯示，無(wú)論注射N(xiāo)OS抑制劑L-NAME還是注射N(xiāo)R的抑制劑Na2WO4，兩種處理均減緩了HR的發(fā)生速度，說(shuō)明NOS途徑和NR途徑同時(shí)參與了NO介導(dǎo)的HR發(fā)生過(guò)程。預(yù)注射N(xiāo)O清除劑c-PTIO后再接種，不親和組合中NO的產(chǎn)生時(shí)間被推遲到接種后48h，同時(shí)

8、，HR的發(fā)生速度被減慢。給葉片分別預(yù)注射N(xiāo)ADPH氧化酶抑制劑咪唑和胞外鈣離子螯合劑EGTA后再接種，發(fā)現(xiàn)兩種藥物均使不親和組合中NO的產(chǎn)生推遲，同時(shí)HR的發(fā)生速度也被減慢。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期工作，初步證明，在小麥抵抗葉銹菌侵染誘發(fā)的過(guò)敏性反應(yīng)過(guò)程中NO在Ca2+和H2O2下游發(fā)揮作用，三者共同參與了該互作體系中HR發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。
　　3、根據(jù)前兩項(xiàng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在小麥抵抗葉銹菌侵染誘發(fā)的HR過(guò)程中，鈣離子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游發(fā)揮重

9、要作用。在此基礎(chǔ)上利用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)小麥和葉銹菌互作過(guò)程中Ca2+介導(dǎo)的基因表達(dá)進(jìn)行了分析。試驗(yàn)選用小麥單基因系TcLr26為材料，TcLr26和‘洛夫林10’含有同一個(gè)抗葉銹基因Lr26。對(duì)TcLr26葉片預(yù)注射EGTA然后再接種葉銹菌，以未注藥處理的葉片做對(duì)照，在接種后不同時(shí)間取葉片提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)。根據(jù)RNA-seq測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括De novo序列拼接、數(shù)據(jù)庫(kù)及功能注釋分析，差異基因

10、表達(dá)分析等。通過(guò)contigs的重組獲得了80975條unigenes，對(duì)這些unigenes進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析，包括COG、GO分析和KEGG通道分析，獲得了相對(duì)于未注藥的樣品，在注射了鈣離子螯合劑EGTA后差異表達(dá)顯著的基因在互作早期共有4311條，其中1673條表達(dá)量上調(diào)，2638條表達(dá)量下調(diào)，在互作后期這些基因共有1416條，其中829條表達(dá)量上調(diào)，587條表達(dá)量下調(diào)，文中對(duì)這些上下調(diào)的基因進(jìn)行了功能注釋分析。同時(shí)，利用實(shí)時(shí)定量

11、PCR（RT-qPCR）技術(shù)對(duì)我們感興趣的10個(gè)基因在互作早、晚期的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致;通過(guò)對(duì)與NO和H2O2代謝相關(guān)基因的RT-qPCR分析，發(fā)現(xiàn)NOS、NR、NR-1、CAT-1和SOD1.1的表達(dá)都受到使用EGTA螯合胞外鈣降低胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，這也為前兩章中經(jīng)藥物學(xué)試驗(yàn)得出的鈣離子在H2O2和NO的上游發(fā)揮作用的推理提供了轉(zhuǎn)錄組水平的分子證據(jù)。
　　綜上所述，我們認(rèn)為，在小麥與葉銹菌互作過(guò)程中，C