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文檔簡(jiǎn)介
1、本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)鈣離子的亞細(xì)胞定位和激發(fā)子刺激小麥懸浮細(xì)胞后胞質(zhì)Ca2+的濃度變化的研究等試驗(yàn)已經(jīng)證明Ca2+/CaM信號(hào)參與了小麥與葉銹菌互作早期的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,并構(gòu)建了TaCaM4-1的誘餌載體,通過(guò)酵母雙雜交試驗(yàn)從受葉銹菌侵染的小麥cDNA文庫(kù)中篩選出了TaCaM4-1下游互作蛋白的陽(yáng)性克隆,TaCAMTA4就是其中之一。在此基礎(chǔ)上,利用5'-RACE PCR技術(shù)和序列拼接得到了TaCAMTA4基因的cDNA全長(zhǎng)。CAMTA(Ca
2、lmodulin-bindingtranscription activator,鈣調(diào)素依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄激活因子)又稱(chēng)SR,是在進(jìn)化中高度保守的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在擬南芥中該家族共有6個(gè)成員,這六個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可以共同調(diào)節(jié)與生物脅迫和非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。通過(guò)前期的RT-qPCR試驗(yàn),對(duì)受葉銹菌侵染的小麥葉片進(jìn)行了TaCAMTA4基因的表達(dá)量分析,發(fā)現(xiàn)不親和互作體系中,TaCAMTA4的表達(dá)量在接種后早期4-8 h呈下調(diào)趨勢(shì),說(shuō)明T
3、aCAMTA4在小麥與葉銹菌互作過(guò)程中可能發(fā)揮著負(fù)調(diào)控作用。
為了探究TaCAMTA4在小麥抗葉銹病過(guò)程中的作用,本試驗(yàn)采用病毒(BSMV)誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)。首先進(jìn)行了VIGS試驗(yàn)條件的優(yōu)化,然后構(gòu)建了TaCAMTA4基因序列中兩個(gè)不同片段的VIGS載體,并通過(guò)單獨(dú)和混合接種病毒比較這幾種情況下所引起的TaCAMTA4的沉默效率;并對(duì)基因沉默后葉銹菌在小麥葉片上的發(fā)育狀況進(jìn)行了觀察。在此基礎(chǔ)上,對(duì)基因沉默的L10
4、葉片于接菌(260)后不同時(shí)間點(diǎn)(前期:8h,12h;后期:20h,36h)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,以期找到與對(duì)照小麥葉片相比差異表達(dá)的基因,并獲得這些基因的注釋信息,初步分析了由TaCAMTA4調(diào)控的基因表達(dá)概況。
本試驗(yàn)獲得的主要結(jié)果如下:
1.對(duì)在小麥L10上實(shí)施的VIGS實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化,通過(guò)構(gòu)建TaCAMTA4基因的兩個(gè)VIGS載體,并混合兩個(gè)病毒感染小麥,比較三者引起的沉默效率,確定了BSMV: TaCAM
5、TA4-2能夠更好的沉默目的基因。
2.在TaCAMTA4沉默的L10葉片上葉銹菌小種165的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制,在熒光顯微鏡下觀察到菌絲團(tuán)的面積較對(duì)照組有所減小;葉片上的孢子堆面積也比對(duì)照組減小。
3.TaCAMTA4沉默的L10對(duì)葉銹菌260小種的抗性增強(qiáng),發(fā)生HR的細(xì)胞面積有減小趨勢(shì)。
4.在TaCAMTA4沉默的L10葉片上接種葉銹菌小種260,以未經(jīng)沉默的材料做對(duì)照,在接種后不同時(shí)間點(diǎn)取樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組
6、測(cè)序,總共產(chǎn)出24185102400 nt的數(shù)據(jù),通過(guò)de novo組裝與拼接,得到72957條Unigene。
5.所有的Unigene中,共有60948條注釋到了NR,NT,Swiss-Prot,KEGG,COG,GO數(shù)據(jù)庫(kù)。
6.通過(guò)對(duì)差異基因的表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)TaCAMTA4沉默的葉片與未發(fā)生該基因沉默的葉片相比,在葉銹菌侵染前期(8h,12h)有3456個(gè)基因上調(diào)表達(dá),576個(gè)基因下調(diào)表達(dá);后期(20h,36
7、h)有4180個(gè)基因上調(diào)表達(dá),633個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。
7.通過(guò)RT-qPCR分析了5個(gè)小麥基因的表達(dá)量,驗(yàn)證了RNA-Seq得到的數(shù)據(jù)是可靠的。
8.通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析和pathway分析,將這些基因進(jìn)行了GO和KEGG分類(lèi),初步證明TaCAMTA4調(diào)控了諸多生理過(guò)程,如代謝過(guò)程,刺激應(yīng)答過(guò)程,生物調(diào)節(jié)等;在調(diào)節(jié)自噬的pathway中,自噬關(guān)鍵基因TaATG8因TaCAMTA4沉默而上調(diào)表達(dá);植物與病原互
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