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文檔簡介
1、水稻白葉枯病是由黃單胞桿菌水稻變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起,是水稻生產(chǎn)中的重要病害,每年造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。多年生產(chǎn)實踐表明,利用抗病基因資源,培育具有高效廣譜抗性的優(yōu)良品種是防治白葉枯病最經(jīng)濟(jì)有效的措施。對白葉枯病抗性基因機制和功能的深入研究,對利用主效抗病基因培育優(yōu)良品種有著重要的指導(dǎo)意義。
本研究從病原和寄主兩方面展開工作,對病原菌研究發(fā)現(xiàn)在所有的白葉枯病原菌中,菲律賓菌系生
2、理小種6(PXO99)對銅離子最敏感。為了研究病原菌PXO99對銅敏感機制,構(gòu)建了抗銅病原菌PXO61的全基因組文庫,并導(dǎo)入到PXO99菌中,篩選抗銅突變體,對突變體測序比對發(fā)現(xiàn)該區(qū)段含有兩個抗銅相關(guān)基因copA和copB。氨基酸比對發(fā)現(xiàn),PXO61與PXO99的copB基因編碼的氨基酸相同,而與PXO61的copA編碼區(qū)相比,PXO99的copA基因編碼區(qū)有六個氨基酸“DGTTQG”的缺失。將PXO99和PXO61的copA基因編碼區(qū)
3、進(jìn)行互換,證實PXO99對銅離子的敏感是由于copA基因編碼區(qū)的六個氨基酸“DGTTQG”缺失造成的。
為了研究copA和copB基因在病原菌中致病力的作用,將來自PXO61的copA和copB基因連接到pHMI載體上,并電轉(zhuǎn)化PXO99菌株中,得到16株耐銅的突變菌株,接種水稻感病品種IR4發(fā)現(xiàn)其致病力增強,而接種抗病品種IRBB13,不能打敗xa13介導(dǎo)的抗性。同時利用同源重組的原理,借助自殺性載體pK18mobsacB,
4、將PXO99小種的copA和copB基因同時突變,得到對銅離子更加敏感的copAB的突變體7株,分別接種IR24和IRBB13,與野生型PXO99相比,致病力有所下降,說明copA和copB具有致病因子的功能。而抗銅突變體,不能使抗病品種完全恢復(fù)感病,說明銅離子只是部分參與xa13介導(dǎo)的抗病,暗示了xa13還存在未知功能。
通過對水稻XA13蛋白家族同源性分析發(fā)現(xiàn),OsXa13與來自禾本科作物玉米的同源基因(ZmXa13)同源
5、性最高,其在N-端(預(yù)測的跨膜區(qū))的同源性高達(dá)90.5%,C-端的同源性為40.6%。通過酵母銅轉(zhuǎn)運互補實驗,證實OsXA13(1-220)可以和OsCOPT1和OsCOPT5形成三位一體的復(fù)合物,發(fā)揮其將銅從細(xì)胞外泵入細(xì)胞內(nèi)的功能。同時酵母雙雜交實驗表明ZmXa13(56-100aa)第94位纈氨酸突變?yōu)楸彼嵊绊懫渑cOsCOPT5的互作。為進(jìn)一步探索OsXA13C端的作用,獲得PXa13:OsXA131-220、Pxa13:ZmXa
6、13、Pxa13:Nos-CzM、Pxa13:NzM-Cos四種轉(zhuǎn)基因植株,接種發(fā)現(xiàn)只有PXa13:Nos-CzM轉(zhuǎn)基因植株能夠恢復(fù)感病,說明OsXa13的C端是感病所必需的并且功能保守。
為了解析Xa13C端功能和作用機制,利用酵母雙雜交的方法,篩選到兩個與XA13相互作用的蛋白CacyBP和HMG,通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗,分別在體外和體內(nèi)證實XA13蛋白和CacyBP及HMG蛋白相互作用的真實性。同時,對Cac
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