NK細胞對顆粒酶B的繼發(fā)性胞吞及其生物學(xué)意義IL-33與EAE發(fā)病的相關(guān)性及其機制.pdf

1、NK細胞是一類重要的固有免疫細胞，在機體抗腫瘤、抗病毒中發(fā)揮重要作用。NK細胞最重要的生物學(xué)效應(yīng)是殺傷靶細胞，其主要機制之一是：NK細胞與靶細胞接觸而形成免疫突觸，NK細胞脫顆粒并向突觸釋放效應(yīng)分子，其中穿孔素可在靶細胞表面形成微孔道，顆粒酶循該孔道進入靶細胞內(nèi)而介導(dǎo)凋亡。靶細胞內(nèi)，顆粒酶啟動凋亡相關(guān)的caspase級聯(lián)反應(yīng)，通過直接作用于pro-caspase，切掉天冬氨酸殘基激活下游caspase而發(fā)揮作用。
　　 免疫突觸

2、內(nèi)部分胞毒效應(yīng)分子未進入靶細胞，其轉(zhuǎn)歸及功能尚不清楚，待闡明的問題是：滯留免疫突觸內(nèi)的穿孔素和顆粒酶是否會傷害NK細胞本身；其代謝與去向如何；等等。文獻已報道，細胞毒性細胞可通過獨特機制處理胞內(nèi)錯位的顆粒酶B（GzmB）和穿孔素（PFN）。例如，NK細胞內(nèi)表達GzmB特異性抑制劑——絲氨酸蛋白酶抑制劑9（PI-9），后者可及時滅活胞內(nèi)滲漏的GzmB。鑒于NK細胞具有連續(xù)殺傷靶細胞的功能，我們提出如下推測：釋放并滯留于免疫突觸的效應(yīng)分子可

3、能被回收而重新利用。
　　 本課題以非何杰金淋巴瘤來源的NK92細胞系為模型，在靶細胞刺激下，探討NK92細胞所釋放GzmB的轉(zhuǎn)歸。
　　 一、NK92細胞在靶細胞刺激下出現(xiàn)繼發(fā)性胞吞現(xiàn)象
　　 1.應(yīng)用苯乙烯染料FM1-43觀察NK92細胞繼發(fā)性胞吞現(xiàn)象苯乙烯染料FM1-43可與細胞膜磷脂雙分子層可逆性結(jié)合，發(fā)出熒光，而其在溶液中則幾乎不能檢出熒光。細胞發(fā)生內(nèi)吞后，苯乙烯染料內(nèi)吞入細胞內(nèi)，細胞膜上熒光可用磷酸鹽

4、緩沖液洗掉。借此原理，本實驗首先將NK92細胞用FM1-43預(yù)染，然后用豬內(nèi)皮細胞（PEC）刺激1h，激光共聚焦顯微鏡（LCM）觀察NK92細胞內(nèi)吞情況。結(jié)果顯示，未用PEC刺激的NK92細胞膜上顯示熒光，PEC刺激的NK92細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞膜后，細胞內(nèi)顯示熒光，提示NK92細胞在胞吐后細胞膜發(fā)生內(nèi)化。
　　 2.靶細胞刺激的細胞膜內(nèi)吞過程依賴于clathrin細胞膜的內(nèi)吞常見形式為依賴于clathrin的經(jīng)

5、典途徑，也可依賴于巨胞飲（macropinocytosis）、小窩蛋白（caveola）和脂筏（lipid raft）等途徑。我們采用clathrin特異性抑制劑CPZ預(yù)處理NK92細胞，再用FM1-43標(biāo)記細胞膜，使用靶細胞刺激后激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)熒光。實驗結(jié)果顯示，CPZ處理后NK92細胞內(nèi)熒光強度顯著降低，提示NK92細胞膜內(nèi)吞依賴于clathrin途徑。同時用流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)熒光強度，結(jié)果顯示使用CPZ后細胞內(nèi)熒光強

6、度約為對照組的48％。我們將NK92細胞用FM1-43標(biāo)記，分為兩組，分別用PEC在4℃和37℃刺激1h，結(jié)果顯示：4℃條件下細胞并不發(fā)生內(nèi)吞，提示NK92細胞內(nèi)吞作用與溫度相關(guān)，是一種主動內(nèi)吞。
　　 二、靶細胞刺激NK92細胞繼發(fā)性胞吞伴隨GzmB回收
　　 1.NK92細胞內(nèi)吞的GzmB進入早期內(nèi)體NK92細胞膜內(nèi)吞過程為經(jīng)典的clathrin依賴途徑，CPZ預(yù)處理的NK92細胞經(jīng)靶細胞（PEC）刺激，收集未刺激組

7、、刺激15min、30min的細胞，免疫熒光檢測GzmB和早期內(nèi)體EEA-1在胞內(nèi)共定位情況，結(jié)果顯示：未刺激組EEA-1與GzmB均有表達，二者未出現(xiàn)共定位；靶細胞刺激15min后，GzmB含量明顯增多，GzmB與EEA-1有明顯共定位，用CPZ處理后共定位顯著減少。靶細胞刺激30min后，GzmB與EEA-1共定位比15min組減少。提示NK92細胞繼發(fā)性胞吞伴隨GzmB回收。
　　 為進一步驗證上述結(jié)果，本實驗設(shè)計針對cl

8、athrin蛋白重鏈的siRNA，采用核轉(zhuǎn)染方法瞬時轉(zhuǎn)染NK92細胞。轉(zhuǎn)染后的細胞用靶細胞刺激15min，免疫熒光法檢測GzmB和EEA-1共定位情況，結(jié)果顯示干擾組EEA-1與GzmB共定位比對照組明顯降低。
　　 2.NK92細胞內(nèi)吞的GzmB可進入溶酶體Clathrin依賴的內(nèi)吞途徑包括從早期內(nèi)體→晚期內(nèi)體→溶酶體的全過程。免疫熒光檢測靶細胞刺激60min后NK92細胞GzmB與lamp1共定位情況。結(jié)果顯示，與未刺激組相

9、比，GzmB與lamp1出現(xiàn)明顯共定位；使用CPZ或siRNA后，共定位明顯減少。
　　 GzmB與lamp1共定位提示GzmB進入溶酶體，且進入后并未被降解。為此，使用溶酶體酶抑制劑leupeptin處理NK92細胞，免疫熒光檢測GzmB和lamp1共定位，結(jié)果顯示共定位并未增加，提示GzmB在溶酶體內(nèi)未被降解，可供分選重復(fù)利用。
　　 三、抑制NK92細胞內(nèi)吞能顯著降低殺傷靶細胞活性采用K562作為NK92細胞的靶細

10、胞，CFSE-PI法在不同效靶比（2.5:1，5:1，10:1）條件下借助流式細胞術(shù)檢測殺傷率。結(jié)果顯示：相對于對照組，不同效靶比條件下經(jīng)CPZ 預(yù)處理的NK92細胞，其殺傷活性明顯下降（16.93％vs1.45％，20.44％vs1.69％，30.22％vs2.79％）。應(yīng)用siRNA 干擾clathrin后，重復(fù)以上細胞毒性實驗，得到相似結(jié)果，相比于對照組，不同效靶比條件下干擾組殺傷活性明顯下降（23.18％vs10.63％，25.

11、31％vs13.02％，38.69％vs15.51％）。
　　 四、NK92細胞殺傷靶細胞后上清及胞內(nèi)GzmB水平檢測為檢測CPZ對NK92細胞胞吐后上清和細胞內(nèi)顆粒酶B水平的影響，在10:1效靶比條件下，NK92細胞與K562作用1h、3h、5h，ELISA檢測上清GzmB水平，Western-blot檢測胞內(nèi)GzmB水平。結(jié)果顯示，隨殺傷時間延長，對照組和CPZ處理組上清GzmB水平逐漸上升，與對照組相比，1h和5h組CPZ

12、處理組上清GzmB水平略有上升（1.8ng/mlvs2.0ng/ml，2.45ng/mlvs2.8 ng/ml），3h組GzmB水平有所下降（2.7ng/mlvs2.25ng/ml）。相應(yīng)各個時間點Western-blot檢測胞內(nèi)GzmB，殺傷后1h、3h、5h，CPZ預(yù)處理的NK92細胞內(nèi)GzmB水平與對照組相比下降。
　　 五、結(jié)論：
　　 1.靶細胞刺激下，NK92細胞出現(xiàn)胞吐及發(fā)生繼發(fā)性內(nèi)吞，內(nèi)吞現(xiàn)象依賴于cla