臍帶干細胞的分離、鑒定及分化為心肌和內皮細胞的實驗研究.pdf

1、心血管疾病嚴重威脅人類的健康，細胞移植或體外構建組織工程移植物將是一個很有前景的治療選擇。但組織工程移植物面臨再血管化或內皮化的問題，最近研究發(fā)現(xiàn)干細胞在體外可以分化為心肌和內皮細胞，對細胞移植和構建組織工程移植物有非常重要的意義。骨髓間充質干細胞是研究最多的干細胞，但是隨著年齡的增加，骨髓間充質干細胞的數(shù)量和體外增殖分化能力都明顯減弱，這需要我們去尋找更好的干細胞來源，臍帶組織是非常有希望的干細胞替代來源。 第一部分，采用膠原

2、酶消化法從臍帶組織中分離干細胞，新鮮分離的臍帶細胞在培養(yǎng)72h后，開始貼壁，5天后貼壁細胞開始增多，形成細胞克隆，傳代培養(yǎng)，細胞逐漸純化，形態(tài)呈均一的細長梭形。流式細胞儀分析這些細胞表達CD13，CD29，CD44，CD90，CD166和MHC-Ⅰ，而不表達造血和內皮細胞的標志物，如CD31、CD34、CD38、CD45、CD106、CD117，CD144和MHC-Ⅱ，經多次傳代后，表面分子表達無明顯改變。在成骨細胞和成脂肪細胞誘導培養(yǎng)

3、后，VonKossa染色和油紅O染色陽性，說明其能夠分化為骨細胞和脂肪細胞。這說明分離的臍帶細胞與骨髓間充質干細胞具有相似的特性，證明了其干細胞特性，稱之為UCDS細胞。 第二部分，研究了在5-氮胞苷的作用下，UCDS細胞能否分化為心肌樣細胞。5-氮胞苷誘導后，細胞的形態(tài)不斷發(fā)生變化，但是沒有觀察到明顯的肌管形成，也沒有觀察到可以跳動的心肌細胞。RT-PCR檢測顯示分化后的UCDS細胞表達心肌特異性基因肌鈣蛋白T，免疫組化檢測誘

4、導后的細胞表達心肌特異性α-肌動蛋白、肌球蛋白和肌鈣蛋白T，表達率在50％以上。電鏡下觀察，誘導4周后，UCDS細胞有明顯的肌絲樣結構形成，說明在5-氮胞苷的作用下，UCDS細胞能夠分化為心肌樣細胞。 第三部分，研究在內皮細胞生長因子和堿性成纖維細胞生長因子的作用下，UCDS細胞能否向內皮細胞方向分化。在體外經過誘導之后，細胞形態(tài)不斷發(fā)生變化，形成網(wǎng)格樣結構。免疫熒光顯示，分化后的UCDS細胞CD31、CD34染色陽性，具有攝取