淫羊藿苷誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：
　　 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離及定向培養(yǎng)是目前組織工程學(xué)的熱點(diǎn)。研究淫羊藿苷對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)作用，以及誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化的可能。嘗試為骨組織工程找到一個(gè)新的體外誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的方案。
　　 方法：
　　 無菌條件下取39～40周健康產(chǎn)婦剖腹產(chǎn)后1h的臍帶（均征得產(chǎn)婦及其家屬同意），去除外膜及血管后，將臍帶組織剪碎，接種于培養(yǎng)瓶中。采用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)并傳代。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長

2、情況，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物(CD34，CD44，CD105，CD45)。取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞生長至80％-90％融合時(shí)分為2組進(jìn)行誘導(dǎo)分化，空白對照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入淫羊藿苷和基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)并檢測成骨細(xì)胞標(biāo)志物ALP、堿性磷酸酶染色、堿性磷酸酶活性測定、鈣化結(jié)節(jié)的檢測。將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞培

3、養(yǎng)4天后，可見組織塊周圍細(xì)胞成放射狀生長，類似成纖維細(xì)胞，形態(tài)均一，貼壁狀態(tài)。培養(yǎng)15天后，培養(yǎng)瓶有80％-95％融合，按照1:2或者1:3的比率傳代，傳代后4h細(xì)胞貼壁，1-6代細(xì)胞12h貼壁率＞85％，24h貼壁率可達(dá)90％。6～8d細(xì)胞長滿瓶底，細(xì)胞融合率可達(dá)100％。傳代細(xì)胞在生長的過程中呈現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。第3代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫組化染色，顯示表面標(biāo)CD44、CD105強(qiáng)陽性，CD34、CD45陰性，檢測結(jié)果符合人U

4、CMSCs的特征。誘導(dǎo)培養(yǎng)后形態(tài)學(xué)檢測：實(shí)驗(yàn)組可見大量臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞由漩渦狀排列向多角形，立方形細(xì)胞發(fā)展?？瞻讓φ战M干細(xì)胞無明顯變化。成骨性檢測：隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)后細(xì)胞液中成骨細(xì)胞特征性堿性磷酸酶強(qiáng)陽性表達(dá)并且有鈣沉積。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)ALP含量與對照組比較有顯著性差異(P＜0.001)，實(shí)驗(yàn)組鈣化結(jié)節(jié)染色強(qiáng)陽性。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)證明了人臍帶中可以提取干細(xì)胞并在體外采用組織塊貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)，傳代，