透性化肝素黃桿菌的固定化及其降解肝素的研究.pdf

1、肝素屬長(zhǎng)鏈糖胺聚糖（GAG），由硫酸化的葡糖胺和己糖醛酸以β—1，4糖苷鍵交叉連接而成。低分子量肝素（LMWH）則是采用不同方法降解肝素獲得的寡糖片段。與肝素相比，LMWH具有選擇性強(qiáng)、抗血栓作用增強(qiáng)等特點(diǎn)，在臨床上應(yīng)用越來(lái)越廣泛。不同降解方法所得到的肝素寡糖具有不同的結(jié)構(gòu)，從而具有不同的生物學(xué)活性。與化學(xué)降解法相比，酶降解法制備LMWH具有反應(yīng)條件溫和、酶切位點(diǎn)清楚、不改變肝素結(jié)構(gòu)以及不引入異物等特點(diǎn)。肝素裂解酶是一類能夠特異性裂解肝

2、素和類肝素主鏈糖苷鍵的酶，最初是從肝素黃桿菌中發(fā)現(xiàn)并分離出的。肝素酶的穩(wěn)定性差，對(duì)其純化過(guò)程會(huì)造成酶活性的巨大損失，因而產(chǎn)率很低。固定化酶技術(shù)因?yàn)榭梢钥朔阜€(wěn)定性差、易失活、不能重復(fù)利用等問(wèn)題而備受關(guān)注。本研究以兩株肝素黃桿菌為材料，在對(duì)其進(jìn)行透性化處理提高通透性的基礎(chǔ)上研究其最佳固定化條件，對(duì)制得的固定化細(xì)胞的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，并進(jìn)一步研究了固定化肝素黃桿菌降解肝素制備LMWH的反應(yīng)條件、產(chǎn)物性質(zhì)等，結(jié)果表明固定化細(xì)胞具有較好的操作穩(wěn)

3、定性和貯藏穩(wěn)定性，在合適的反應(yīng)條件下能夠制備分子量較為均一、活性較好的LMWH。主要研究?jī)?nèi)容如下： ⑴完整的肝素酶活性測(cè)定體系的建立使用天青A（Azure A）法建立了肝素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而建立了完整的肝素酶粗酶液、透性化肝素黃桿菌以及固定化肝素黃桿菌的肝素酶活性測(cè)定體系，確保對(duì)酶活水平的測(cè)定貫穿整個(gè)研究的各個(gè)階段，以準(zhǔn)確地計(jì)算酶活回收率以及穩(wěn)定性，作為考查粗酶液、透性化細(xì)胞以及固定化細(xì)胞的重要指標(biāo)。 ⑵肝素黃桿菌的培養(yǎng)

4、及誘導(dǎo)條件的確定將兩株肝素黃桿菌分別接種于DSMZ培養(yǎng)基和NBRC培養(yǎng)基，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，選擇NBRC培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；將菌種于30℃、200r/min條件下培養(yǎng)一定時(shí)間至培養(yǎng)液OD600為1．0左右時(shí)加入無(wú)菌的肝素鈉溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，通過(guò)對(duì)不同濃度肝素鈉溶液誘導(dǎo)產(chǎn)酶的研究，確定誘導(dǎo)用肝素鈉溶液的濃度為0．1 g/mL；為確保肝素黃桿菌保持菌株的純正與較高的酶活水平，確定了使用初步篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)、鏡檢、測(cè)定肝素酶活性和肝素酶I基因HepA P

5、CR鑒定的多角度機(jī)制的菌種鑒定方法；分別使用超聲波細(xì)胞破碎法和高壓勻質(zhì)法對(duì)培養(yǎng)和誘導(dǎo)后的肝素黃桿菌菌體進(jìn)行破碎，得到肝素酶粗酶液，比較了兩種方法破碎細(xì)胞的效果，確定使用高壓勻質(zhì)法制備肝素酶粗酶液；對(duì)粗酶液的操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果表明粗酶液的酶活穩(wěn)定性較差，反應(yīng)5次后酶活性降低至10％以下，而保存于4℃時(shí)酶活性逐步降低，貯存120 h后酶活性降至35％左右。 ⑶肝素黃桿菌的透性化處理分別使用曲拉通X—100（Trit

6、on X—100）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、吐溫80（Tween80）以及溶菌酶對(duì)肝素黃桿菌進(jìn)行透性化處理，考查各種透性化試劑處理的操作復(fù)雜性和作用效果，確定透性化處理的條件為使用等體積的100 mg/L的溶菌酶于30℃處理30 min，制得的透性化肝素黃桿菌的肝素酶活性回收率達(dá)到50％以上；對(duì)酶活穩(wěn)定性的研究表明，透性化細(xì)胞的酶活穩(wěn)定性較粗酶液有較大提高，在最初5個(gè)批次的反

7、應(yīng)過(guò)程中酶活性損失較明顯，從第6次反應(yīng)開(kāi)始酶活基本保持平穩(wěn)水平，經(jīng)過(guò)10次反應(yīng)后，酶活保留40％以上。 ⑷透性化肝素黃桿菌的固定化使用海藻酸鈣包埋法對(duì)透性化肝素黃桿菌進(jìn)行固定化，通過(guò)正交試驗(yàn)確定固定化最佳條件為1．5％的海藻酸鈉、5％的CaCl2溶液，硬化20 h；對(duì)固定化細(xì)胞的最適溫度、溫度穩(wěn)定性、最適pH、pH穩(wěn)定性等理化性質(zhì)進(jìn)行研究，確定了固定化細(xì)胞的最適溫度為30℃，最適pH為7．0。與粗酶液相比，固定化細(xì)胞的溫度穩(wěn)定性

8、有很大提高，最適溫度、最適pH的范圍有所擴(kuò)大；在最佳條件下制備的固定化肝素黃桿菌的酶活回收率平均達(dá)到30％左右；固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性相對(duì)于透性化細(xì)胞有很大提高，反應(yīng)10次后酶活性保留60％以上，于4℃貯存120 h后酶活保留90％以上。 ⑸固定化肝素黃桿菌制備LMWH使用固定化肝素黃桿菌對(duì)肝素進(jìn)行三個(gè)批次的不同時(shí)間的酶解作用，經(jīng)過(guò)超濾、濃縮及凍干后得到OH—1、OH—2和OH—3三組肝素寡糖樣品，對(duì)制得的肝素寡糖進(jìn)

9、行190～350 nm波長(zhǎng)范圍掃描，顯示在232 nm處有最大吸收；測(cè)定了三種肝素寡糖的部分理化性質(zhì)，使用多角度激光散射儀．高效凝膠滲透色譜聯(lián)用法（GPC—MALLS）測(cè)定肝素寡糖的分子量，三種肝素寡糖樣品的重均分子量分別為8798 D、6709 D和5671 D，分散度（polydispersity）分別為1．375、1．383和1．408；采用羊血漿法測(cè)定肝素寡糖的抗凝效價(jià)，COATEST Heparin試劑盒測(cè)定其抗FXa活性，三