肝素化膠原-殼聚糖海綿的制備及評價.pdf

1、燒燙傷是生活中常見的意外傷害。目前，臨床上多采用包扎療法處理燒燙傷創(chuàng)面。包扎療法中所用的創(chuàng)面敷料作為創(chuàng)面的臨時覆蓋物，在創(chuàng)面愈合過程中，它可以暫時替代皮膚起到保護作用，防止創(chuàng)面感染發(fā)炎，為創(chuàng)面愈合提供一個有利的環(huán)境。創(chuàng)面敷料根據(jù)敷料形式可以分為薄膜型敷料、水凝膠型敷料、噴霧型敷料和海綿型敷料。其中，海綿型敷料具有比較大的孔隙率，能夠吸收較多創(chuàng)面滲出液，并且具有較好的透氣性，不會造成創(chuàng)面滲出液的積聚。針對深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面滲出液較多的特點，本

2、課題選用海綿型敷料進行研究。創(chuàng)面敷料的常用材料有膠原、殼聚糖、透明質酸、海藻酸鹽等，本課題選擇生物大分子-膠原和殼聚糖為基材，并復合肝素研制海綿型敷料用于深Ⅱ度燒燙傷的創(chuàng)面愈合。
　　臨床研究證實肝素(Heparin)具有治療燒燙傷的作用。肝素促進創(chuàng)面修復的作用機制如下:肝素能夠改善創(chuàng)面微循環(huán)，有效防止血栓形成;還可以保護并協(xié)同機體在創(chuàng)傷局部分泌的表皮生長因子(EGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)發(fā)揮促愈合的作用;肝素還可以影響

3、膠原重建，肝素和膠原酶形成復合物，調(diào)控膠原纖維的重新排列，使膠原纖維排列更加整齊，使創(chuàng)面逐漸上皮化。雖然有肝素用于燒燙傷治療臨床實踐，但其應用并未普及。因為肝素注射給藥后在體內(nèi)的半衰期較短，需要頻繁給藥，而肝素全身高劑量給藥易發(fā)生出血，所以臨床上使用肝素治療燒燙傷以局部用藥的方式更佳。膠原(Collagen)是皮膚的主要成分。膠原作為生物大分子，具有良好的生物相容性、生物可降解性和弱抗原性，所以膠原在生物醫(yī)學材料和藥物緩釋領域中有著廣泛

4、的應用。但是單一組分的膠原海綿機械強度較低，并且易降解，所以一般加入交聯(lián)劑或氨基聚糖增加膠原海綿的機械強度，調(diào)節(jié)膠原海綿的降解性。殼聚糖(Chitosan)是一種重要的組織工程生物材料，具有良好的生物相容性、抗菌活性、生物可降解性，被制作成人工皮膚和可降解手術縫合線等。大量研究證實，殼聚糖對細菌和真菌都具有抑制作用。尤其是對一些創(chuàng)面常見的細菌，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢桿菌的都具有明顯的抑菌作用。
　　本研究針對滲出液

5、多的深Ⅱ度感染創(chuàng)傷，設計了肝素化膠原/殼聚糖海綿。以膠原和殼聚糖這兩種材料為基材，使用EDC/NHS交聯(lián)劑復合肝素，制成了膠原和殼聚糖配比一定(w/w,2∶8)，二者的質量總百分含量不同的肝素化膠原/殼聚糖海綿，并對總百分含量不同的海綿的理化性質，包括表觀密度、孔隙率、吸水率、保濕性、溶失率等進行了系統(tǒng)研究，篩選出理化性質較優(yōu)海綿配方。通過測定抑菌圈的大小對篩選出的海綿的體外抑菌活性進行了評價，并對篩選出的海綿主要生物相容性進行了評價，

6、包括體外細胞毒性、急性全身毒性和溶血率。在此基礎上，利用大鼠全皮膚切層模型和豚鼠深Ⅱ度燙傷感染模型，對制備的肝素化膠原/殼聚糖海綿進行了抗感染、促愈合作用及機制考察。本研究主要取得以下研究成果:
　　1.豬皮Ⅰ型膠原的制備及結構確證。采用酸膨脹-胃蛋白酶降解法從豬皮中提取膠原，以SigmaⅠ型膠原標準品為對照品，通過紫外光譜掃描、紅外光譜掃描、SDS-PAGE凝膠電泳以及羥脯氨酸含量測定等結構確證實驗，證實提取的膠原為Ⅰ型膠原。<

7、br>　　2.膠原和殼聚糖總百分含量不同的肝素化膠原/殼聚糖海綿的制備及理化性質研究。采用兩步凍干法制備肝素化膠原/殼聚糖海綿，首先制備膠原和殼聚糖配比一定(w/w,2∶8)，二者的總質量百分含量不同（1.2％、2.4％和3.0％）的膠原/殼聚糖海綿;然后用EDC/NHS交聯(lián)劑復合肝素后再次凍干獲得肝素化膠原/殼聚糖海綿。評價了膠原和殼聚糖總百分含量不同的海綿的理化性質，包括表觀密度、孔隙率、吸水率、保濕性、透氣率以及溶失率等，篩選出理

8、化性質較為優(yōu)越的合適百分含量的海綿做進一步研究。同時測定了膠原和殼聚糖總百分含量為2.4％的肝素化膠原/殼聚糖海綿（2.4％C-C-H海綿）中肝素的體外釋放曲線，證實了海綿敷料中的肝素能夠緩慢釋放，不存在突釋現(xiàn)象。
　　3.所研制海綿敷料的體外抑菌作用評價。選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢桿菌這三種創(chuàng)面易感染的細菌為研究對象，評價了自制海綿敷料體外抑菌作用。證實自制海綿敷料對這三種細菌均具有明顯的抑菌作用，而商品膠原海綿沒

9、有抑菌作用。
　　4.所研制海綿敷料的生物安全性考察。評價了膠原和殼聚糖總百分含量為2.4％的交聯(lián)膠原/殼聚糖海綿（2.4％C-C海綿）、2.4％C-C-H海綿和商品膠原海綿的部分相容性，包括體外細胞毒性、急性全身毒性和溶血率。結果表明自制的海綿敷料具有良好的生物安全性。
　　5.肝素化膠原/殼聚糖海綿對大鼠全皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響。在大鼠全皮膚切層模型造模14天時，拍照記錄創(chuàng)面輪廓，并利用Image J軟件計算創(chuàng)面愈合率，

10、然后取皮膚組織進行HE染色和VEGE，EGF的免疫組化檢測。結果表明，紗布組、商品膠原海綿組、2.4％C-C海綿組和2.4％C-C-H海綿組的創(chuàng)面愈合率分別為85.5％、99.8％、98.3％和90.1％。HE結果表明，愈合效果最好的2.4％C-C海綿組，其次是商品膠原海綿組、2.4％C-C-H海綿組、紗布組。術后14天時VEGE和EGF的免疫組化結果表明，VEGF在各組創(chuàng)面組織中都有所表達，其中2.4％C-C-H海綿組為強陽性(+++

11、)，商品膠原海綿組和2.4％C-C海綿組為中度陽性(++)，紗布組為弱陽性(+)。EGF在各組的創(chuàng)面組織中均有表達，商品膠原海綿組、2.4％C-C海綿組和2.4％C-C-H海綿組的創(chuàng)面組織中EGF的量差別不明顯，均為中度陽性，紗布組為弱陽性。雖然在創(chuàng)面愈合后期2.4％C-C-H海綿組的創(chuàng)面組織中VEGF和EGF的量比其他三組略多，該海綿能夠促進創(chuàng)面愈合，但是在創(chuàng)面愈合初期該海綿中的肝素會抑制血小板的聚集和釋放，并且肝素具有抗炎活性，這兩

12、方面的作用會延遲創(chuàng)面愈合。所以在術后14天時，2.4％C-C-H海綿組中的大鼠創(chuàng)面愈合率略低于2.4％C-C海綿組中的大鼠創(chuàng)面愈合率。顯示在全皮膚缺損創(chuàng)面愈合中，2.4％C-C海綿效果更優(yōu)。
　　6.肝素化膠原/殼聚糖海綿對豚鼠深二度燒傷感染模型創(chuàng)面愈合的影響。分別于術后4、7天時，拍照記錄創(chuàng)面輪廓，并利用ImageJ軟件計算創(chuàng)面愈合率，并取皮膚組織進行HE和免疫組化檢測。結果表明，術后4天，紗布組、商品膠原海綿組、2.4％C-C

13、海綿組和2.4％C-C-H海綿組的創(chuàng)面愈合率分別為19.0％、23.6％、31.0％和34.0％。術后7天，紗布組、商品膠原海綿組、2.4％C-C海綿組和2.4％C-C-H海綿組的創(chuàng)面愈合率分別為36.9％、39.5％、41.2％和57.0％。HE染色結果表明，紗布組、商品膠原海綿組創(chuàng)面有大量的膿細胞和炎細胞，而2.4％C-C海綿組和2.4％C-C-H海綿組創(chuàng)面只有少量的膿細胞和炎細胞。愈合效果最好的2.4％C-C-H海綿組，其次是2.

14、4％C-C海綿組、商品膠原海綿組、紗布組。術后4天時，VEGE和EGF的免疫組化結果表明，VEGF在各組創(chuàng)面組織中都有所表達，其中2.4％C-C-H海綿組為中度陽性(++)，其他三組為弱陽性(+)。EGF在紗布組（-）的創(chuàng)面組織中沒有表達，而在其他三組的創(chuàng)面組織中均有所表達。并且EGF在2.4％C-C-H海綿組(+++)的創(chuàng)面組織中的量高于2.4％C-C海綿組(++)和商品膠原海綿組(++)。這表明，2.4％C-C-H海綿組對于豚鼠深Ⅱ