凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)高光學(xué)純L-乳酸的機理研究.pdf

1、光學(xué)純L-乳酸是生物塑料-聚乳酸的單體。耐熱的凝結(jié)芽孢桿菌2-6是一株產(chǎn)高光學(xué)純L-乳酸的菌株（光學(xué)純度＞99％），然而關(guān)于這株菌產(chǎn)高光學(xué)純L-乳酸機理方面的內(nèi)容了解的很少。通過全基因組測序及注釋結(jié)果，在該菌株中發(fā)現(xiàn)三個可能與乳酸代謝相關(guān)的酶:NAD依賴型L-乳酸脫氫酶(L-nLDH)，NAD依賴型D-乳酸脫氫酶(D-nLDH)和乙醇酸氧化酶(GOX)，并對這三個酶進(jìn)行系統(tǒng)的研究，探索這些酶與光學(xué)純?nèi)樗岬年P(guān)系。同時，選取德氏乳桿菌DSM

2、20081（D-乳酸生產(chǎn)菌）和植物乳桿菌DSM20174（DL-乳酸生產(chǎn)菌）作為對照菌株進(jìn)行比較分析。
　　首先，本論文分析了三株菌的乳酸代謝關(guān)鍵酶的體外酶學(xué)性質(zhì)。在DSM20081中只檢測到D-nLDH的活性。來源于DSM20174的L-nLDH和D-nLDH的催化效率接近。而凝結(jié)芽孢桿菌2-6中雖然D-nLDH有活性，但是對丙酮酸的催化效率kcat/Km(1.9×103M-1 s-1)低于L-nLDH(5.8×103 M-1

3、s-1)，并且Km值(5.9 mM)高于L-nLDH(3.8mM)，說明L-nLDH對丙酮酸具有更高的親和力。
　　其次，利用指數(shù)期的菌體全細(xì)胞提取物分析三株菌的L-nLDHs和D-nLDHs體內(nèi)酶活，結(jié)果表明DSM20081的D-nLDH體內(nèi)酶活是L-nLDH的50倍，DSM20174的D-nLDH和L-nLDH體內(nèi)酶活相近。凝結(jié)芽孢桿菌2-6中未檢測到D-nLDH活力，因此發(fā)酵產(chǎn)物為L-乳酸。進(jìn)一步的采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電

4、泳后，進(jìn)行活性染色，結(jié)果作為DL-型乳酸生產(chǎn)菌DSM20174的D-nLDH和L-nLDH均被檢測出來，而凝結(jié)芽孢桿菌2-6僅檢測出L-nLDH，與D-型乳酸生產(chǎn)菌DSM20081僅檢測出D-nLDH相呼應(yīng)。
　　最后，采用熒光定量PCR對發(fā)酵不同時期ldhL、ldh和go基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。凝結(jié)芽孢桿菌2-6的ldhL的轉(zhuǎn)錄水平，在發(fā)酵各個時期均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于ldhD和go的轉(zhuǎn)錄水平，另兩株乳桿菌的ldhD的轉(zhuǎn)錄水平高于同菌的ld