米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的代謝調(diào)控研究.pdf

1、米根霉(.Rhizopus oryzae)是發(fā)酵生產(chǎn)高光學(xué)純度的L-乳酸的主要菌株,但目前針對(duì)米根霉的研究,仍存在誘交選育盲目性大,菌株易退化.主要代謝機(jī)理不明確,發(fā)酵參數(shù)不穩(wěn)定等問題.本文基于微生物的代謝控制發(fā)酵及代謝控制育種理論,以米根霉碳代謝關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶(LDH)與乙醇脫氫酶(ADH)為對(duì)象,較系統(tǒng)地研究了LDH及ADH的分離純化與催化特性,Mg<'2>和Zn<'2+>離子及不同通氣條件下的米根霉發(fā)酵調(diào)控模式,進(jìn)而篩選出米根霉

2、高產(chǎn)L.乳酸的突變菌株.主要結(jié)論如下: (1)確定了EDTA定鈣法快速測定發(fā)酵液中乳酸含量的方法,用10﹪的NaOH來調(diào)節(jié)測定液的pH值,鈣黃綠素作為指示劑,測定結(jié)果有較好的重復(fù)性與準(zhǔn)確性;建立了反相C<,18>色譜柱,準(zhǔn)確測定發(fā)酵液中5種有機(jī)酸的HPLC法. (2)米根霉LDH粗酶液在30～50℃條件下有較高的穩(wěn)定性,最適pn 7.5,容易被MK<'2+>、Ca<'2+>激活,被K<'+>,Zn<'2+>抑制:LDH對(duì)NA

3、DH的米氏常數(shù)K<,m>為7.22x10<'-4>mol/L,對(duì)丙酮酸的米氏常數(shù)K<,m>為1.24x10<'-3>mol/L;ADH粗酶液的最適催化溫度為25℃,最適反應(yīng)pH值7.5,EDTA、Mg<'2+>和Ca<'2+>對(duì)該酶活力的影響較小,但較大的Zn<'2+>濃度對(duì)該酶有一定的抑制作用,該酶對(duì)乙醛的米氏常數(shù)K<,m>為6.8966x10<'-4> mol/L. (3)米根霉.AS3.3461的發(fā)酵液中添加Mg<'2+>能

4、夠提高LDH的活性,發(fā)酵液中Mg<'2+>濃度為0.04﹪時(shí)對(duì)LDH活性的激活作用最強(qiáng),此時(shí)乳酸的最大濃度搖瓶條件下為63.17g/L,罐發(fā)酵條件下為65.33g/L;少量Zn<'2+>能激活A(yù)DH的活性;Zn<'2+>濃度為0.03﹪時(shí),對(duì)LDH/活性有一定激活作用,此時(shí)發(fā)酵液中的乳酸濃度最大.但隨著zn<'2+>濃度增加到0.05﹪時(shí),對(duì)LDH的最大活力產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制,乳酸產(chǎn)量顯著降低.搖瓶發(fā)酵液中Mg<'2+>濃度為0.04﹪,Z

5、n<'2+>為0.03﹪時(shí),乳酸轉(zhuǎn)化率最大,為64.24g/L:5L發(fā)酵罐條件下最大乳酸轉(zhuǎn)化率Mg<'2+>、Zn<'2+>濃度與搖瓶相同,此時(shí)乳酸含量為66.37g,L. (4)米根霉AS3.346l的搖瓶裝液量為10﹪時(shí),乳酸產(chǎn)量達(dá)到最大,為69.33g/L,此時(shí)LDH活力為6.14U/mL,30﹪裝液量下的乳酸含量及LDH活力均較低;乙醇濃度隨著裝液量的增加而增大,300裝液量下可達(dá)17.48 g/L:搖床轉(zhuǎn)速為220 r/

6、min時(shí),乳酸產(chǎn)量達(dá)到最大,為68.14g/L;采用單膜封口發(fā)酵時(shí),乳酸濃度為67.5g/L,.LDH活力為5.83U/mL,分別比雙膜封口發(fā)酵提高了64.4﹪和49.9﹪;雙膜封口發(fā)酵下乙醇濃度與ADH活力分別比單膜封口發(fā)酵提高了30.0﹪和25.5﹪.5L罐發(fā)酵中,30﹪的裝液量生成的乳酸量最大,達(dá)到69.95g/L,50﹪裝液量生成的乳酸量最小,為64.80g/L;發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為600 r/min的發(fā)酵條件乳酸產(chǎn)量及LDH活力均最大

7、,分別為71.23g/L和6.79U/mL;0.7 L/(L-min),通氣條件下發(fā)酵液中的乳酸濃度最大,達(dá)到71.78g/L.搖瓶發(fā)酵中,裝液量20﹪,搖瓶轉(zhuǎn)速220r/min下可得到最大乳酸轉(zhuǎn)化率,此時(shí)乳酸含量為68.14g/L,LDH活力為5.97U/mL,乙醇濃度為16.28g/L,ADH活力為15.44U/mL;5L發(fā)酵罐條件下40﹪裝液量,600r/min轉(zhuǎn)速及0.7 L/(L·rain)通氣速率,可得到最大乳酸轉(zhuǎn)化率,此時(shí)

8、乳酸含量為71.78g/L,LDH活力為6.22U/mL,乙醇濃度為14.83g/L,ADH活力為13.69U/mL. (5)研究采用復(fù)合誘變,篩選ADH活力降低的米根霉突變菌株,確定了NTG濃度為0.1mg/mL,時(shí).誘變效果最佳;UV誘變的最佳照射時(shí)間為180s;篩選出的ADH突變菌株swsp-1-2 L-乳酸發(fā)酵濃度達(dá)到了81.0g/L,比原始菌株提高了36.3﹪;乙醇濃度為5.6g/L,比出發(fā)菌株降低了66.7﹪.

9、 (6)以米根霉(Rhizopus oryzae)基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增得到含有l(wèi)dhL的DNA片段,序列測定獲得998bp,該序列GenBank登陸號(hào)為EF152288.PCR產(chǎn)物T/A克隆后再雙酶切,將ldhL片段連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET17b,得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET17b-ldhL.pET17b-ldhL轉(zhuǎn)化E coli BL21(DE3),構(gòu)建的工程菌再經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng),SDS-PAGE電泳分析菌體細(xì)胞成分,結(jié)果表明