蛹蟲草多糖的發(fā)酵條件優(yōu)化、結(jié)構(gòu)及抗氧化活性研究.pdf

1、蛹蟲草（Cordyceps militaris）是蟲草屬的模式種，具有廣泛的生物活性和藥食用價值，多糖(polysaccharides)是蛹蟲草的重要活性成分之一。本研究通過單因素實驗、響應(yīng)面法對蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)多糖的最佳發(fā)酵條件進行探索，對蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)生的胞內(nèi)多糖和胞外多糖分別進行提取、分離、純化及基本理化性質(zhì)分析，并進一步對純化后的蛹蟲草胞內(nèi)多糖和胞外多糖的結(jié)構(gòu)及體外抗氧化活性進行分析，為蛹蟲草液體發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基

2、礎(chǔ)，也為蛹蟲草多糖的開發(fā)、應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.本研究以蛹蟲草BYB-08（Cordyceps militaris,BYB-08）為出發(fā)菌株，通過單因素法篩選出影響蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)多糖的最適培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件，然后在單因素實驗的基礎(chǔ)上運用Plackett-Burman因子設(shè)計實驗，成功篩選出3個顯著性因素，即蔗糖、酵母浸出粉和KH2PO4，運用Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計得到蛹蟲草產(chǎn)多糖的最

3、佳發(fā)酵條件為:蔗糖6.41％、酵母浸出粉3.79％、KH2PO40.072％、溫度25℃、發(fā)酵時間6d、轉(zhuǎn)速150r/min、接種量10％、裝液量100mL/250mL，驗證實驗測得總多糖含量達3.19g/L，這與Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計模型的預(yù)測值3.23g/L較為接近，說明該模型準(zhǔn)確可靠，擬合性良好。
　　2.采用超聲波輔助提取蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)生的胞內(nèi)多糖，水提醇沉法提取胞外多糖，經(jīng)脫蛋白、透析等處理分別得到胞

4、內(nèi)粗多糖(Intracellular polysaccharides，IPS)和胞外粗多糖（Exopolysaccharides，EPS），然后采用DEAE-cellulose-52和SepharoseCL-6B對IPS及EPS進一步分離純化。經(jīng)紫外光譜法、比旋度法及凝膠滲透色譜法對純化后的胞內(nèi)多糖IPS-3和胞外多糖EPS-3進行純度鑒定，紫外光譜法結(jié)果顯示IPS-3和EPS-3為不含核酸的均一多糖;比旋度法和凝膠滲透色譜法結(jié)果也表明

5、IPS-3和EPS-3均為均一多糖組分;同時測得IPS-3和EPS-3的平均分子量Mw分別為67，920Da和37，350Da，且均含有較高含量的多糖、糖醛酸以及少量糖蛋白質(zhì)。采用紅外光譜（IR）、氣相色譜(GC)對純化后的蛹蟲草多糖初級結(jié)構(gòu)進行表征，結(jié)果表明:IPS-3和EPS-3的紅外圖譜相似，都具有多糖的特征吸收峰，IPS-3既有α-糖苷鍵構(gòu)型又有β-糖苷鍵構(gòu)型，同時含有β-D-甘露糖，而EPS-3在811cm-1、852cm-1

6、有吸收峰，表明EPS-3存在含有α-糖苷鍵構(gòu)型的吡喃甘露糖;氣相色譜結(jié)果顯示IPS-3和EPS-3具有相同的單糖組成，即甘露糖、葡萄糖和半乳糖，且均不含鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，IPS-3的單糖組成及分子摩爾比為:D-甘露糖:D-半乳糖:D-葡萄糖=4.58∶3.85∶1.0;EPS-3的單糖組成及分子摩爾比為:D-甘露糖∶D-葡萄糖∶D-半乳糖=2.66∶8.88∶1.0。
　　3.通過剛果紅實驗、粒度分布和紫外光譜分析對IPS-

7、3和EPS-3多糖溶液的分子鏈構(gòu)象進行研究，結(jié)果顯示IPS-3和EPS-3的多糖溶液均不能與剛果紅形成絡(luò)合物，不具有三股螺旋結(jié)構(gòu)，而是無規(guī)線團的分子鏈構(gòu)象;不同濃度多糖溶液(0.01、1.0mg/mL)、放置時間(0、24h)對IPS-3和EPS-3粒度分布變化顯示，隨多糖溶液濃度增大和放置時間增加，多糖分子間相互纏繞并產(chǎn)生聚集，從而形成不同的空間構(gòu)象，使IPS-3和EPS-3的平均粒徑逐漸增大，粒度分散指數(shù)也發(fā)生了一定的變化。紫外光譜

8、分析結(jié)果顯示溫度和金屬離子對蛹蟲草多糖的構(gòu)象影響不大，而pH、尿素和二甲亞砜能破壞IPS-3和EPS-3分子內(nèi)或分子間的氫鍵，使多糖分子的不對稱性增強，從而對多糖的構(gòu)象產(chǎn)生影響。
　　4.掃描電鏡顯示IPS-3和EPS-3緊密聚集，呈無規(guī)則交叉的鏈狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，存在分支并表現(xiàn)出一定的柔順性，同時IPS-3和EPS-3的固態(tài)表觀形貌還存在一定的差異;X-射線衍射進一步證實IPS-3和EPS-3均為無定形態(tài);差式掃描量熱儀對IPS-3和

9、EPS-3的熱特性分析結(jié)果顯示，IPS-3和EPS-3的玻璃化溫度分別為55.6℃、143.8℃，且在高溫條件下可發(fā)生吸熱和放熱反應(yīng)。
　　5.以DPPH自由基、·OH、O2·-的清除能力、Fe2+螯合能力以及總還原能力為指標(biāo)，對蛹蟲草多糖IPS-3和EPS-3的體外抗氧化活性進行對比分析，結(jié)果表明:IPS-3和EPS-3對DPPH自由基都具有良好的清除效果，同時具有清除·OH、O2·-和螯合Fe2+的能力，也具有一定的總還原能力