甜橙CsMYBF1基因的功能鑒定和調(diào)控機(jī)理研究.pdf

1、柑橘是世界上最重要的果樹(shù)之一，富含種類(lèi)豐富的苯丙烷類(lèi)化合物。苯丙烷類(lèi)化合物作為植物中重要的次生代謝類(lèi)物質(zhì)，在柑橘果實(shí)品質(zhì)的形成及對(duì)逆境的抵御等方面都起到了重要作用。苯丙烷類(lèi)化合物的代謝調(diào)控機(jī)制研究是有效利用此類(lèi)化合物的基礎(chǔ)，而目前柑橘中苯丙烷類(lèi)化合物代謝調(diào)控的研究仍非常之少，這也一定程度上限制了柑橘中相關(guān)遺傳改良工作的開(kāi)展。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與了植物中眾多生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物苯丙烷代謝的

2、相關(guān)功能在多種植物中已有廣泛的報(bào)道。本研究以柑橘中的MYB轉(zhuǎn)錄因子為切入點(diǎn)，通過(guò)生物信息學(xué)方法，在全基因組范圍內(nèi)鑒定了MYB家族各成員的相關(guān)信息。并從中挑選出CsMYBF1作為候選基因，對(duì)其潛在的調(diào)控苯丙烷代謝的相關(guān)功能及機(jī)制展開(kāi)了深入研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.甜橙基因組范圍內(nèi)R2R3類(lèi)型的MYB家族成員分析。從甜橙基因組中共鑒定出100個(gè)R2R3類(lèi)型的MYB轉(zhuǎn)錄因子，其中有87個(gè)基因不均勻地分布在9條染色體上，以2號(hào)染色

3、體上分布為最多。甜橙中存在21個(gè)片段復(fù)制和8個(gè)串聯(lián)復(fù)制的MYB基因。構(gòu)建了甜橙與擬南芥中MYB家族成員的進(jìn)化樹(shù)，將甜橙中的100個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子分為29個(gè)亞族，MYB基因的基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析進(jìn)一步證實(shí)了分類(lèi)結(jié)果的可靠性。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和定量PCR實(shí)驗(yàn)提供了各MYB成員的基因表達(dá)信息，結(jié)合基因間的進(jìn)化關(guān)系特點(diǎn)，本研究預(yù)測(cè)了各MYB基因的功能，為后期開(kāi)展柑橘中MYB基因的功能研究提供了參考。
　　2.CsMYBF1基因的功能鑒定及調(diào)控

4、機(jī)理研究。從組學(xué)分析結(jié)果中挑取了可能與黃酮醇類(lèi)化合物調(diào)控相關(guān)的CsMYBF1做進(jìn)一步的功能分析。利用RACE技術(shù)克隆得到了CsMYBF1基因全長(zhǎng)，進(jìn)化分析表明CsMYBF1與已報(bào)道的黃酮醇調(diào)控相關(guān)的MYB基因有較近的親緣關(guān)系?；虮磉_(dá)分析表明，CsMYBF1基因在果皮組織、幼果果肉及新葉中有較高的表達(dá)。亞細(xì)胞定位分析顯示CsMYBF1定位在細(xì)胞核中。拷貝數(shù)分析顯示CsMYBF1基因在多個(gè)柑橘類(lèi)型中均為單拷貝。轉(zhuǎn)錄激活分析表明CsMYBF

5、1可能需要與其他蛋白形成復(fù)合體來(lái)行使其轉(zhuǎn)錄激活的功能。
　　將CsMYBF1基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)入番茄，成功得到了轉(zhuǎn)基因番茄植株。次生代謝產(chǎn)物分析表明，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中羥基肉桂酸類(lèi)化合物含量明顯增加，黃酮醇類(lèi)物質(zhì)含量沒(méi)有顯著差異。數(shù)字表達(dá)譜分析鑒定出了一系列差異表達(dá)基因，包括糖酵解途徑、莽草酸途徑及苯丙烷途徑中的多個(gè)差異基因。在柑橘愈傷中干涉CsMYBF1基因的表達(dá)，顯著降低了愈傷組織中羥基肉桂酸類(lèi)、黃酮醇類(lèi)及黃酮類(lèi)化合物的含量。定量P

6、CR結(jié)果表明一系列柑橘中苯丙烷途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)也明顯降低。在山金柑中干涉CsMYBF1基因的表達(dá)也得到了相似的結(jié)果。
　　啟動(dòng)子激活實(shí)驗(yàn)表明，CsMYBF1可以激活番茄和柑橘中苯丙烷途徑上的多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子。進(jìn)一步分析表明，CsMYBF1可以激活柑橘中但不能激活番茄中的CHS基因啟動(dòng)子;CsMYBF1可以通過(guò)作用于MYPLANT順式元件直接激活相應(yīng)的苯丙烷途徑結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子。酵母單雜交與EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)CsMYBF1可