新型角膜灌流培養(yǎng)系統(tǒng)的研制及在角膜保存中的應(yīng)用.pdf

1、目的： 1．探索并設(shè)計(jì)一種新型角膜灌流培養(yǎng)系統(tǒng)，進(jìn)而優(yōu)化傳統(tǒng)器官培養(yǎng)保存中角膜的生存環(huán)境，并預(yù)測其在角膜保存中應(yīng)用的可行性。 2．研究此新型培養(yǎng)系統(tǒng)對器官培養(yǎng)保存兔角膜的生存環(huán)境、內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響，檢驗(yàn)其在器官培養(yǎng)角膜保存中的應(yīng)用效果。 3．使用本培養(yǎng)系統(tǒng)保存的兔角膜進(jìn)行穿透性角膜移植（PKP）研究，進(jìn)一步評價(jià)其在長期保存角膜內(nèi)皮細(xì)胞（CEC）活性方面的可靠性。 方法： 1．利用制圖軟件設(shè)計(jì)一種

2、帶有底座和角膜固定結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)裝置，并利用精密蠕動泵組合構(gòu)建角膜灌流培養(yǎng)系統(tǒng)及動物模型。根據(jù)灌流速度不同，隨機(jī)將20只兔角膜片分為4組進(jìn)行灌流培養(yǎng)，時(shí)間為4周。保存到期后，檢測培養(yǎng)液中pH值、葡萄糖、乳酸、微生物等指標(biāo)；對各組角膜片行錐藍(lán)聯(lián)合茜素紅活性染色計(jì)算CEC密度，觀察不同灌流速度對角膜保存效果的影響，篩選最佳的灌流速度。 2．利用新研制的角膜灌流培養(yǎng)系統(tǒng)以及傳統(tǒng)的密閉和定期換液保存3種方式對60只兔角膜進(jìn)行器官培養(yǎng)保存實(shí)驗(yàn)

3、，每種方法又按保存時(shí)間l周、2周、3周、4周分為4個(gè)小組，每小組各保存5只角膜，另有2只角膜進(jìn)行灌流培養(yǎng)保存2月。保存到期后，檢測培養(yǎng)液中pH值、葡萄糖、乳酸、微生物學(xué)等指標(biāo)；對各組角膜片行錐藍(lán)聯(lián)合茜素紅活性染色計(jì)算CEC密度、死亡率、六角形細(xì)胞百分率；對保存時(shí)間最長組角膜行Na+-K+ATP酶及琥珀酸脫氫酶酶組織化學(xué)染色及透射電鏡觀察。 3．新西蘭大白兔15只，其中5只（10只角膜）作為PKP供體，10只作為PKP受體。供體角

4、膜用灌流培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)保存，按保存時(shí)間4周、8周分為兩組，每小組各保存5只角膜，兩組均行穿透性角膜移植動物實(shí)驗(yàn)。術(shù)后不同時(shí)間對所有實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行大體觀察、裂隙燈檢查、A超角膜測厚。術(shù)后30d處死后，對植片CEC進(jìn)行錐藍(lán)茜素紅聯(lián)合染色檢查。 結(jié)果： 1．實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的動物模型進(jìn)行灌流培養(yǎng)，除流速在5ul/min時(shí)，保存前后培養(yǎng)液主要成分變化有顯著性外，其余三組無明顯變化；綜合培養(yǎng)效果及培養(yǎng)液用量考慮，10ul/min的灌流速

5、度相對更加具有優(yōu)勢。 2．不同保存方式間比較顯示，灌流培養(yǎng)能夠提供相對穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，有效地防止污染．經(jīng)灌流培養(yǎng)后的角膜與其他方法保存后的相比擁有更高的CEC密度、更好的酶組織活性以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 3．經(jīng)灌流培養(yǎng)保存后的兔角膜行PKP術(shù)，術(shù)后觀察各組植片厚度均逐漸減小，術(shù)后30天時(shí)植片均透明。植片活性染色均可見較高密度的活性CEC存在。各組PKP術(shù)后的植片透明率、厚度無明顯差異。 結(jié)論： 1．研究結(jié)果表