腦腫瘤干細(xì)胞分化抑制機(jī)制的研究.pdf

1、[目的]:從新鮮的人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本中分離、培養(yǎng)腦腫瘤干細(xì)胞（brain tumor stem cells，BTSCs），觀察研究它們的細(xì)胞生物學(xué)特征，尤其是分化特征。在此基礎(chǔ)上，利用最新的分子遺傳學(xué)檢測(cè)方法CGH—array（array—based comparative genomic hybridization，CGH—array）檢測(cè)腦腫瘤干細(xì)胞中基因組發(fā)生的異常改變，從中尋找腦腫瘤發(fā)生及惡性進(jìn)展相關(guān)的基因。對(duì)檢測(cè)出的感興趣基因

2、進(jìn)一步通過(guò)組織芯片技術(shù)，檢測(cè)其在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，并分析其意義。在腦腫瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展過(guò)程中，細(xì)胞融合很可能是其中的機(jī)制之一，因此，本研究，我們利用致瘤能力低下的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G和飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察有無(wú)細(xì)胞融合現(xiàn)象發(fā)生，并就細(xì)胞融合對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征產(chǎn)生的影響進(jìn)行初步探討。 [方法]:①?gòu)娜颂ツX組織中培養(yǎng)神經(jīng)球；從一例混合性膠質(zhì)瘤的原發(fā)和復(fù)發(fā)手術(shù)標(biāo)本中利用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)腦腫瘤球；利用免疫磁珠細(xì)胞分離系統(tǒng)從

3、腦腫瘤球中分離出腦腫瘤干細(xì)胞，從神經(jīng)球中分離出神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs），并通過(guò)流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)分離系統(tǒng)的效率；利用純化的腦腫瘤干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，觀察BTSCs和NSCs的形態(tài)變化，同期利用免疫細(xì)胞組化和流式細(xì)胞儀檢測(cè)腦腫瘤干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中CD133、Nestin、GFAP、β—TubulinⅢ等分化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的變化。②分別從腦腫瘤干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞中抽取出DNA，利用美國(guó)

4、Spectral Genomics公司提供的CGH—array芯片檢測(cè)腦腫瘤干細(xì)胞中發(fā)生的基因組改變，根據(jù)異常BAC克?。╞acterial artificial clone，BAC）在基因組序列中對(duì)應(yīng)的位置，尋找感興趣的基因。進(jìn)一步利用免疫細(xì)胞化學(xué)或組織芯片，檢測(cè)感興趣基因在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況。③從轉(zhuǎn)基因綠色熒光小鼠腹腔中收集飼養(yǎng)細(xì)胞，和難致瘤的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系TG98共培養(yǎng)，利用相差顯微鏡、熒光顯微鏡觀察共培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)特征的改

5、變；由于飼養(yǎng)細(xì)胞本身發(fā)綠色熒光，故對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞特異性標(biāo)志物nestin的單抗進(jìn)行紅色熒光標(biāo)記，在兩種細(xì)胞共培養(yǎng)過(guò)程中定期爬片，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察有無(wú)融合細(xì)胞出現(xiàn)；通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)共培養(yǎng)細(xì)胞中綠色熒光細(xì)胞所占比例的動(dòng)態(tài)變化及染色體倍體有無(wú)異常變化；收集共培養(yǎng)前后的瘤細(xì)胞，按照5×106／只行裸小鼠皮下及顱內(nèi)接種，比較致瘤能力有無(wú)差異。 [結(jié)果]:①?gòu)脑l(fā)和復(fù)發(fā)腫瘤標(biāo)本中均成功地培養(yǎng)出了懸浮生長(zhǎng)的腫瘤球；通過(guò)免疫磁珠分離

6、系統(tǒng)成功地分離出了純度較高的CD133+瘤細(xì)胞，即腦腫瘤干細(xì)胞，而且懸浮腫瘤球中腦腫瘤干細(xì)胞所占的比例明顯高于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞；克隆形成實(shí)驗(yàn)表明：只有CD133+瘤細(xì)胞能形成腫瘤球。體外分化實(shí)驗(yàn)顯示：BTSCs起初貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)也轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?，然而從第十天開(kāi)始，瘤細(xì)胞形態(tài)逐步向圓形回復(fù)，并相互聚集，再次形成懸浮腫瘤球；NSCs按固有規(guī)律分化，從圓形到多角形和梭形，再到星形膠質(zhì)細(xì)胞和長(zhǎng)纖維狀的神經(jīng)元，未能再形成神經(jīng)球。與此同時(shí)，分化相關(guān)標(biāo)

7、志物的檢測(cè)表明：剛開(kāi)始分化時(shí)，兩者都以CD133和nestin表達(dá)為主，而GFAP、β—TubulinⅢ的表達(dá)很低；然而分化開(kāi)始后，神經(jīng)干細(xì)胞中CD133，Nestin的表達(dá)逐漸、持續(xù)降低，直至消失，而分化標(biāo)記物GFAP和β—tubulinⅢ則逐漸、持續(xù)升高；在腦腫瘤干細(xì)胞，CD133和nestin的表達(dá)剛開(kāi)始也下降，但自第10天起出現(xiàn)反彈而呈上升趨勢(shì)；與此相反，GFAP和β—TubulinⅢ表達(dá)則呈先升后降的趨勢(shì)，同樣也在第10天出現(xiàn)

8、反彈。增殖周期及倍體檢測(cè)表明，腦腫瘤干細(xì)胞比神經(jīng)干細(xì)胞的增殖更活躍，染色體倍體的變化也更復(fù)雜。原發(fā)腫瘤干細(xì)胞和復(fù)發(fā)腫瘤干細(xì)胞相比，后者在細(xì)胞增殖及倍體變化方面均顯示了惡性進(jìn)展的特征。②神經(jīng)干細(xì)胞沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因組拷貝的擴(kuò)增或丟失，而在腦腫瘤干細(xì)胞中則發(fā)現(xiàn)了大量的異常克隆，其中，在原發(fā)BTSCs中，異?？寺?shù)為160個(gè)，而在復(fù)發(fā)BTSCs中，異?？寺?shù)更多，達(dá)182個(gè)，原發(fā)和復(fù)發(fā)BTSCs相比較，變化相同的克隆，即共變化克隆占大多數(shù)。從共變化

9、克隆中，發(fā)現(xiàn)了眾多與腫瘤發(fā)生及惡性進(jìn)展密切相關(guān)的基因，包括CDK7，p181NK，Rb，4ING3，ING5，CHES1，MYCL1，ERBB4，RAB40C等。值得關(guān)注的是，INK4—cyclin D/CDK4/6—Rb—E2F細(xì)胞周期信號(hào)傳導(dǎo)通路中的上游負(fù)性調(diào)控子，INK4的家族成員，新發(fā)現(xiàn)的抑瘤基因，p18INK4存在明顯的拷貝丟失，而其下游的著名抑瘤基因Rb也存在拷貝丟失。另外，在原發(fā)BTSCs和復(fù)發(fā)BTSCs中還發(fā)現(xiàn)了一些各自

10、異常的克隆，值得關(guān)注的是，在復(fù)發(fā)BTSCs，尋找到的腫瘤相關(guān)基因大多與RAS癌基因家族相關(guān)，其中RAB13和RAB27屬于RAS癌基因家族成員，而RASAL2、RRAS2和RASA3雖不屬于RAS癌基因家族，但均可激活RAS基因，上述基因在復(fù)發(fā)BTSCs均表現(xiàn)為拷貝擴(kuò)增。KSR2可抑制RAS基因活性，但在復(fù)發(fā)BTSCs中表現(xiàn)為丟失。進(jìn)一步檢測(cè)了抑瘤基因p18INK4在腦腫瘤干細(xì)胞及膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，結(jié)果在腦腫瘤干細(xì)胞中為陰性，而在

11、大多數(shù)的膠質(zhì)瘤組織中為陽(yáng)性，且隨著惡性程度的增加而表達(dá)增強(qiáng)。③膠質(zhì)瘤細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)過(guò)程中，在相差顯微鏡下觀察到巨大型細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察到巨大、多突起的綠色熒光細(xì)胞；流式細(xì)胞檢測(cè)表明，共培養(yǎng)過(guò)程中，綠色熒光細(xì)胞的比例一開(kāi)始就呈快速下降趨勢(shì)，但降至0.6%左右時(shí)保持相對(duì)穩(wěn)定；通過(guò)流式細(xì)胞儀從共培養(yǎng)細(xì)胞中分離出熒光細(xì)胞后行染色體倍體檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約8%的細(xì)胞為異倍體細(xì)胞。上述結(jié)果提示飼養(yǎng)細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)過(guò)程中，少數(shù)細(xì)胞有可能發(fā)

12、生了融合。共培養(yǎng)細(xì)胞爬片后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)個(gè)別發(fā)綠色熒光的大細(xì)胞同時(shí)也發(fā)紅色熒光，并清晰地顯示出了雙核征，直觀地顯示細(xì)胞融合的發(fā)生；動(dòng)物致瘤實(shí)驗(yàn)表明，共培養(yǎng)前，膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植裸小鼠致瘤率為25%，而共培養(yǎng)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞致瘤能力提高至100%。 [結(jié)論]:①成功地從原發(fā)和復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中培養(yǎng)出了腦腫瘤干細(xì)胞，和神經(jīng)干細(xì)胞相比，腦腫瘤干細(xì)胞突出地展現(xiàn)出了內(nèi)在的分化抑制潛能；②p18INK4和RB基因拷貝丟失導(dǎo)致的IN

13、K4—cyclin D/CDK4/6—Rb—E2F信號(hào)傳導(dǎo)通路異?？赡苁悄z質(zhì)瘤來(lái)源細(xì)胞分裂周期加快而無(wú)法正常分化，繼而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的原因。③細(xì)胞生物學(xué)和分子遺傳學(xué)結(jié)果均顯示了復(fù)發(fā)BTSCs比原發(fā)BTSCs更高的惡性特征，這一差異表明腦腫瘤干細(xì)胞是一功能性概念，是處于動(dòng)態(tài)變化中的，同時(shí)也反映了膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)往往意味著惡性程度增高的特點(diǎn)。④p18INK4功能的喪失可能是部分膠質(zhì)瘤發(fā)生的原因。作為抑瘤基因在大多數(shù)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中表達(dá)，且隨著惡性度增高

14、而表達(dá)增加的事實(shí)并不否認(rèn)p18INK4的抑瘤功能，相反，p18INK4的高表達(dá)很可能是作為負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制而被動(dòng)高表達(dá)，目的是減緩細(xì)胞分裂，但在其它因子驅(qū)動(dòng)下，變得“無(wú)能為力”了。⑤膠質(zhì)瘤細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)后出現(xiàn)了細(xì)胞融合，盡管融合的比例很低，但對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征的改變不可低估，飼養(yǎng)細(xì)胞的主要成分是巨噬細(xì)胞，推測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞融合后，不但可以逃避免疫系統(tǒng)的清除，而且還借助巨噬細(xì)胞高度的運(yùn)動(dòng)性、適應(yīng)性和可塑性在機(jī)體中存活下來(lái)，繼續(xù)