色鹽桿菌DSM22428T新種鑒定及其甜菜堿醛脫氫酶研究.pdf

1、菌株DSM22428T是本實驗室從東營濱海鹽地堿蓬分離的一株內(nèi)生中度嗜鹽菌，其可生長的NaCl濃度范圍為0.6–20％（w/v），比嗜鹽古菌有更廣的耐鹽范圍，對外界鹽濃度的劇烈變化有更好的適應(yīng)性。本實驗室的前期研究證實，菌株DSM22428T在高鹽條件下可通過在細胞內(nèi)積累滲透保護劑甘氨酸甜菜堿來抵抗外界的滲透脅迫，維持細胞內(nèi)外滲透平衡。甘氨酸甜菜堿是細菌，植物，動物最有效的無毒滲透保護劑，目前已經(jīng)對植物中的betB進行了深入研究，且為植

2、物抗逆工程的重點。BADH基因序列在不同的物種中有較大差異，因此賦予菌株抗?jié)B透脅迫能力也不相同。細菌以膽堿為底物經(jīng)膽堿脫氫酶CDH和甜菜堿醛脫氫酶BADH催化合成甘氨酸甜菜堿，而甜菜堿醛脫氫酶BADH是甘氨酸甜菜堿合成的關(guān)鍵酶。此外，甜菜堿醛脫氫酶還在病原菌入侵宿主時發(fā)揮重要的作用。因此對DSM22428T甜菜堿醛脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)進行研究有助于深入了解甜菜堿醛脫氫酶的特點，對于進一步明確該菌的抗鹽機理有重要意義。同時經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)菌株D

3、SM22428T應(yīng)屬于色鹽桿菌屬的一個新種，相關(guān)鑒定工作已經(jīng)開展。但是隨著分子鑒定在細菌新種鑒定中的作用越來越大，DNA雜交、脂肪酸、極脂分析等已經(jīng)成為必要的項目，因此對DSM22428T進行更多的分子鑒定對于確定其在鹽單胞菌科中的分類地位是十分必要的。
　　本文首先將色鹽桿菌DSM22428T甜菜堿醛脫氫酶基因betB在大腸桿菌中進行了異源表達及功能驗證，然后進行了酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究，最后對色鹽桿菌DSM22428T進行了新

4、種的鑒定。具體實驗結(jié)果如下：
　　1.根據(jù) GenBank中色鹽桿菌DSM22428T甜菜堿醛脫氫酶基因 betB序列，設(shè)計一對上下游引物，以色鹽桿菌DSM22428T總DNA為模板擴增獲得 betB基因的全序列，雙酶切后連接到表達載體 pET-15b上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)，在重組大腸桿菌中成功進行了甜菜堿醛脫氫酶的異源表達。在不同 NaCl濃度梯度基本培養(yǎng)基中添加終濃度為1mM的膽堿，接種色鹽桿菌DSM22428T

5、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和對照相比，在鹽脅迫條件下，外界提供一定濃度的膽堿，可以明顯提高野生菌株的耐鹽能力，說明野生菌株甜菜堿醛脫氫酶具有明顯的滲透調(diào)節(jié)功能。為了進一步驗證異源表達的甜菜堿醛脫氫酶是否具有滲透調(diào)節(jié)功能，在不同 NaCl濃度梯度的LB培養(yǎng)基中添加終濃度為1mM的膽堿，接種重組大腸桿菌，用IPTG誘導(dǎo)表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶有 betB基因的重組大腸桿菌生長速度遠高于帶空質(zhì)粒的對照組，尤其在高鹽條件下效果更加明顯，色鹽桿菌DSM22428T甜菜堿

6、醛脫氫酶基因 betB的導(dǎo)入顯著提高了重組大腸桿菌的耐鹽性，說明異源表達的色鹽桿菌DSM22428T甜菜堿醛脫氫酶同樣具有滲透調(diào)節(jié)功能。
　　2.用0.3mM的IPTG低溫誘導(dǎo)重組大腸桿菌過量表達甜菜堿醛脫氫酶蛋白，高壓勻漿機破碎菌體細胞，并通過鎳柱親和層析、離子交換層析、分子篩柱層析進行蛋白純化。最終得到了較純的目的蛋白，蛋白濃度約為1.5mg/ml，單體分子量在61KDa左右，與生物信息學(xué)分析的DSM22428T甜菜堿醛脫氫酶

7、分子量相同。
　　3.將提純的甜菜堿醛脫氫酶進行酶學(xué)性質(zhì)研究，經(jīng)測定酶的最適pH為7.5，酶的比活為3.6×10-2 U/mg。同時研究發(fā)現(xiàn)該酶具有耐鹽性，鹽濃度為2M時，該酶仍保留40%左右的酶活，說明該酶具有較強的抗高鹽濃度的能力。
　　4.按照 Halomonadaceae科菌種鑒定的最小標準對菌株 DSM22428T進行分類學(xué)研究。菌株DSM22428T鹽濃度生長范圍為0.6–20%（w/v）（最適鹽濃度為5-6%，

8、w/v），生長溫度為5-45 oC(最適溫度為35℃)，生長 pH范圍為5-9(最適 pH為7-8)，可積累聚-β-羥丁酸和產(chǎn)胞外多糖。主要含有的脂肪酸為 summed feature3(C16:1ω7c/C15:0 iso2-OH，23.1%)，C18:1ω7c(22.6%)和C16:0(22.3%)。主要的呼吸醌為泛醌 Q-9(86%)。主要的極性脂為：磷脂酰乙醇胺 PE；磷脂酰甘油PG；一種未知糖脂GNL；一種未知糖磷脂PGNL；

9、雙磷脂酰甘油DPG；一種未知脂類L；一種未知氨基脂AL。16S rRNA基因序列及級聯(lián)的16S rRNA，gyrB，rpoD基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示菌株DSM22428T屬于色鹽桿菌屬的新種。其最相近菌株為Chromohalobacter israelensis DSM6768T(95.4%16S rRNA序列相似性)。菌株DSM22428T與 C. israelensis DSM6768T，C. salexigens DSM3043T