C-反應(yīng)蛋白對心肌細(xì)胞直接損傷作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景冠狀動脈硬化性疾病(coronaryatherosclerosisdisease，CAD)是心血管系統(tǒng)的常見疾病，是發(fā)達(dá)國家的常見死因，在發(fā)展中國家的發(fā)病率也迅速上升。CAD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，在其發(fā)展過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、血小板和凝血因子的活化、體內(nèi)促凝與抗凝的失衡、高血脂、高血粘度及血流動力學(xué)改變等因素均促進(jìn)粥樣斑塊和血栓形成。然而其原發(fā)因素和發(fā)病機(jī)理仍不清楚。關(guān)于CAD的發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說，其中炎癥學(xué)說備受重視，越來越多的證據(jù)

2、表明炎癥在冠心病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后過程中起很重要的作用。炎癥因子與冠心病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)系是目前冠心病研究領(lǐng)域的一個熱點，揭示炎癥因子與冠心病的關(guān)系有重要臨床意義。大量臨床研究表明，C-反應(yīng)蛋白(C-reactiveprotein，CRP)與冠心病的發(fā)生、發(fā)展、危險度分層以及預(yù)后密切相關(guān)，因此CRP作為冠心病的獨立危險因素之一，被認(rèn)為是預(yù)測未來心血管危險的重要炎癥標(biāo)記物。然而CRP與冠心病的內(nèi)在聯(lián)系尚未明了，CRP是否僅僅作為冠心

3、病發(fā)生、發(fā)展過程中伴隨炎癥而出現(xiàn)的一種標(biāo)志物(passivebystander)，還是直接參與了冠心病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后(culprit)?最近的研究發(fā)現(xiàn)，在早期動脈粥樣硬化斑塊中有CRP沉積，表明CRP與早期粥樣硬化斑塊的形成存在病理上的聯(lián)系，而且CRP與斑塊的不穩(wěn)定相關(guān)。此外，CRP還能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO、介導(dǎo)血管平滑肌凋亡。在急性心肌梗死患者心臟的梗死區(qū)也有CRP沉積，而且CRP的含量與梗死的范圍呈正相關(guān)。一些嚴(yán)重的急性冠脈

4、綜合征(acutecoronarysyndrome，ACS)和感染病人血中CRP達(dá)到300mg/L，如此高的CRP濃度是否對心肌有直接損傷作用，尚未見文獻(xiàn)報道。本研究通過CRP干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞了解其對心肌細(xì)胞的直接作用以及可能的機(jī)制，以進(jìn)一步探討CRP的致病機(jī)制并為冠心病提供可能的新的治療靶點。 目的：選擇識別鼠等動物的抗cTnI單抗，配對建立可用于檢測大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiactroponinI，cTnI)的

5、ELISA方法，對心肌細(xì)胞損傷進(jìn)行評價。從腹水中純化人CRP，干預(yù)原代培養(yǎng)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，觀察CRP與細(xì)胞作用的部位，研究CRP對心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清cTnI、氧自由基清除及脂質(zhì)過氧化的影響，對細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、線粒體膜電位以及細(xì)胞凋亡的影響。 方法：1.以大鼠心肌勻漿代替cTnI篩選可識別大鼠cTnI的一對單抗組合，以這對單抗分別作為捕捉抗體和信號抗體建立能檢測大鼠cTnI的雙抗夾心ELISA系統(tǒng)，通過檢測異丙腎上腺素?fù)p傷大鼠

6、血清中cTnI濃度，驗證該系統(tǒng)的效果。 2.采用Immobilizedp-AminophenylPhosphorylCholineGel親和層析柱從腫瘤患者腹水中純化CRP，通過電泳和westernblot對純化產(chǎn)物的純度和活性進(jìn)行分析和鑒定。 3.培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，通過充氮氣造成缺氧/復(fù)氧損傷模型，加入CRP干預(yù)72小時，實驗分為未缺氧組、缺氧2小時組、缺氧4小時組和缺氧8小時組，每一組又分為4個亞組：未加CR

7、P組、CRP10μg/ml組、CRP55μg/ml組與CRP100μg/ml組。 4.觀察CRP干預(yù)對細(xì)胞形態(tài)、搏動率、密度以及培養(yǎng)液上清的影響。 5.通過免疫組化和免疫熒光定位確定CRP與細(xì)胞作用的部位、結(jié)合量。 6.通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清cTnI與細(xì)胞超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量，了解CRP對心肌細(xì)胞的損傷作用和因缺氧/復(fù)氧造成的心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的影響。 7.通過激光共聚焦檢測細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度(

8、Fura-3/AM)、線粒體膜電位(羅丹明123)，了解CRP對培養(yǎng)心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣負(fù)荷變化的影響和對細(xì)胞能量代謝的影響。 8.通過流式細(xì)胞檢測了解CRP對心肌細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果1.篩選出一對可識別大鼠cTnI的單抗(14和15號單抗)，用這對單抗建立的雙抗夾心ELISA系統(tǒng)可檢測出6.125ng/ml的大鼠心肌勻漿(約相當(dāng)于0.225ng/ml的cTnI)。用上述系統(tǒng)檢測異丙腎上腺素?fù)p傷大鼠血清中cTnI的濃度，結(jié)

9、果明顯高于生理鹽水對照組(P＜0.05)。 2.采用親和層析法從腫瘤患者腹水中成功純化出CRP，電泳檢測純度約為95﹪，westernblot檢測未見雜帶。 3.缺氧8小時加CRP100μg/ml條件下細(xì)胞密度明顯減少，胞質(zhì)突起變細(xì)變長，胞內(nèi)有明顯的致密顆粒，視野內(nèi)可見大量細(xì)胞碎片。細(xì)胞搏動率總體隨缺氧時間和CRP濃度的增加而增加，其通常在缺氧2小時加CRP100μg/ml條件下以及缺氧4小時加CRP55μg/ml時搏動

10、率最高，約為132次/分鐘左右。但在缺氧8小時組細(xì)胞搏動率普遍低于其他各組，細(xì)胞搏動率約為30-40次/分鐘左右，大部分細(xì)胞未見搏動，只有少數(shù)聚集呈團(tuán)的細(xì)胞可見搏動，且搏動極不規(guī)則。尤其在缺氧8小時加CRP100μg/ml組細(xì)胞幾乎未見細(xì)胞搏動。培養(yǎng)液上清顏色隨缺氧時間和CRP濃度的增加而變黃(PH值降低)。 4.免疫組化和免疫熒光定位顯示CRP主要與細(xì)胞膜結(jié)合，細(xì)胞缺氧時間越長，CRP濃度越高，與細(xì)胞膜結(jié)合的CRP越多。其中細(xì)

11、胞裂解碎片上結(jié)合的CRP最多。 5.在未缺氧組和缺氧2、4小時組細(xì)胞培養(yǎng)上清cTnI濃度隨缺氧時間的增加而升高。缺氧8小時組的cTnI濃度在缺氧2小時和4小時之間，各組cTnI濃度均隨CRP濃度的增加而增加。但在未缺氧組，低濃度的CRP亞組(10μg/ml)cTnI的濃度與未加CRP組無顯著性差異。且隨缺氧時間的增加，因CRP而引起cTnI變化的幅度也明顯增加(P＜0.05)。 6.MDA的改變與cTnI類似。在所有組S

12、OD活性均隨缺氧時間和CRP濃度的增加而減少。但未缺氧組，CRP10、55μg/ml的細(xì)胞上清以及缺氧2小時加CRP10μg/ml條件下的細(xì)胞上清中SOD活性與相應(yīng)未加CRP組無顯著性差異。且隨缺氧時間的增加，因CRP而引起MDA和SOD變化的幅度也明顯增加(P＜0.05)。 7.細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度隨缺氧時間和CRP濃度的增加而增加(P＜0.05)。而線粒體膜電位缺氧時間和CRP濃度的增加而減少(P＜0.05)。 8.

13、細(xì)胞凋亡率隨缺氧時間延長和CRP濃度的升高而增加(P＜0.05)。 結(jié)論1.本研究在國內(nèi)首次建立了一個可識別大鼠cTnI的ELISA檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)可用于大鼠心肌損傷的檢測，為評價大鼠心肌損傷的實驗提供了一個有用的工具。 2.采用PhosphorylCholine親和層析柱從腹水中純化CRP，所得產(chǎn)物純度較高、方法簡單且效率高。 3.采用純氮氣造成缺氧模型時，缺氧8小時可造成大量細(xì)胞不可逆的損傷，由于所剩細(xì)胞較其

14、他組明顯減少，所以對細(xì)胞上清cTnI、SOD和MDA的結(jié)果可產(chǎn)生較大影響，與其他缺氧組不具可比性。討論CRP對細(xì)胞的影響時應(yīng)將缺氧損傷控制在可逆性的范圍之內(nèi)。 4.免疫組化和免疫熒光定位結(jié)果表明細(xì)胞損傷越嚴(yán)重，細(xì)胞膜結(jié)合的CRP就越多；或者可能是細(xì)胞膜結(jié)合的CRP越多，細(xì)胞損傷越嚴(yán)重；或者兩者互為因果。 5.細(xì)胞培養(yǎng)上清cTnI、SOD和MDA結(jié)果表明，CRP作用于損傷組細(xì)胞可進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷，且相同濃度的CRP在已有