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文檔簡介
1、糖尿病(Diabetes mellitus,DM)已成為21世紀世界流行病之一,據(jù)統(tǒng)計到2010年患病人數(shù)達2.40億,到2025年可達2.99億。由于糖尿病可以引起冠心病、腦卒中、失明、截肢等嚴重后果,糖尿病及其并發(fā)癥的防治已經(jīng)給各國造成了嚴重的經(jīng)濟負擔和社會壓力。心血管疾病是DM患者致殘、致死,并造成經(jīng)濟損失的主要原因,現(xiàn)已把防治心血管并發(fā)癥作為當今治療DM的主題,也就是說完成了從DM的昏迷時代到感染時代到心血管時代的飛躍。
2、 糖尿病是冠心病的等危癥,糖尿病引起心血管并發(fā)癥的危害性已逐漸受到重視。目前,糖尿病對心臟的損害局限于對大血管、微血管、動脈粥樣硬化的研究,國內(nèi)外對糖毒性對心肌細胞的直接傷害報道少見。本文通過以體外培養(yǎng)的H9C2心肌細胞為模型,探討不同糖濃度環(huán)境下心肌細胞糖代謝狀況的表達,發(fā)現(xiàn)高糖情況下心肌細胞存在胰島素抵抗及凋亡,揭示糖毒性對心肌細胞存在直接傷害作用,為糖尿病對心臟的損害闡明另一途徑。
Ghrelin是1999年日
3、本科學(xué)家Kojima等從大鼠胃組織中分離和純化了一個由28個氨基酸組成的小分子活性肽,并證實其為生長激素促分泌物受體(Growthhormone secretagogue receptor,GHS-R)的內(nèi)源性配體。研究表明ghrelin在心血管的能量代謝、內(nèi)分泌效應(yīng)、血管效應(yīng)及細胞效應(yīng)方面發(fā)揮了廣泛的作用,Ghrelin對于心血管系統(tǒng)的作用提示其可能在心衰、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)及心肌損傷等病變的防治上具
4、有廣闊的前景。
目前國內(nèi)外并未見ghrelin干預(yù)后心肌細胞糖代謝的變化及對糖毒性的影響的報道。我們知道PI3-Kinase/AKT通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,這條通路不僅在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到很重要的作用,同時也是細胞凋亡過程中重要的一環(huán)。本研究利用RT-PCR及Western方法對不同濃度葡萄糖的大鼠心肌細胞進行mRNA及蛋白定量檢測,揭示出Ghrelin對高糖作用下的心肌細胞起到保護作用的機制。本文力求對高糖引起
5、的心肌細胞的直接傷害作用及Ghrelin的功能的深入研究作出貢獻,為臨床治療提供新的方向與思路。
材料與方法:
一、實驗材料
1、H9C2大鼠心肌細胞系;
2、3H-G(3氚標記-葡萄糖)心肌細胞糖攝取實驗相關(guān)試劑;
3、免疫熒光染色的相關(guān)試劑;
4、流式細胞儀檢測凋亡的相關(guān)試劑;
5、半定量RT-PCR檢測基因mRNA的相關(guān)試劑;
6、 6、Western印跡雜交相關(guān)試劑;
二、實驗方法
1、細胞培養(yǎng)鼠胚心肌細胞(H9C2)在DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清中于37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng),隔天換液,細胞單層生長達80%培養(yǎng)面積后,用0.25%胰蛋白酶消化,根據(jù)情況1:2或1:3傳代,將傳至6-7代的細胞用于實驗。當細胞呈對數(shù)生長后,調(diào)整細胞數(shù)為1×106/L,接種于6孔培養(yǎng)板或30 mm培養(yǎng)皿中,待細胞生長至融合狀態(tài)后用無血清培養(yǎng)
7、基培養(yǎng)24h使細胞呈靜止狀態(tài),更換實驗用液隨機分配為實驗組及對照組進行實驗。
2、實驗分組
A、5.5mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰島素;
B、25 mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰島素;
C、5.5mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰島素+10-8mol/L Ghrelin;
D、25 mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰島素+10-8mol/L Ghre
8、lin;
E、5.5mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰島素+10-7mol/L Ghrelin;
F、25 mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰島素+10-7mol/L Ghrelin。
3、同位素示蹤法檢測不同葡萄糖濃度時,心肌細胞3氚標記-葡萄糖(3H-G)攝取的變化待傳代培養(yǎng)后的細胞處于80-90%融合狀態(tài)時用于實驗。KRH緩沖液洗滌細胞3次。用400ulKRH孵育細胞37℃孵育30mi
9、n。棄去緩沖液,各組分共同繼續(xù)孵育30分鐘。加入3H-G至終濃度0.2uCi/ml30分鐘。用預(yù)冷的PBS沖洗3次,將細胞裂解于0.5mol/LNaOH中,吹打混勻細胞(37℃裂解2小時),收集細胞并離心(800r,2min)。樣品移至液閃瓶內(nèi),加入液閃液(PPO4.0g、POPOP0.1g/1000ml二甲苯)2ml,液體閃爍計數(shù)法測定檢測各組的CPM值。
4、吖啶橙(Acridine Orange,AO)熒光染色各實驗
10、組細胞按上述分組處理后,吸棄各孔中上清,PBS漂洗3次,每次3min,95%冷乙醇固定20min,濾紙吸干,1%醋酸作用30s,PBS洗1 min,加入0.01%AO染色5 min,PBS洗1 min,分色30 s,PBS洗3次,封片,于激發(fā)波長為405nm的熒光相差顯微鏡下立刻觀察。
5、Hoechst33258染色將實驗各組細胞按上述分組處理后,吸棄各孔中上清,PBS漂洗2次,每次3min,加入1 ml的4%甲醛溶液,
11、4℃固定細胞10min,棄去固定液,PBS洗二次,滴加100μL Hoechst33258工作液,室溫染色10min,流水沖凈,于340nm波長的熒光顯微鏡下觀察。
6、流式細胞儀檢測H9C2細胞凋亡率細胞收集:懸浮細胞直接收集到10ml的離心管中,每樣本細胞數(shù)為(1~5)×106/mL,500~1000r/min離心5min,棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗滌1次,500~1000r/min離心5min。用100ul的標記溶液
12、重懸細胞,室溫下避光孵育10~15min。500~1000r/min離心5min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次。加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min,避光并不時振動。流式細胞儀分析:流式細胞儀激發(fā)光波長用488nm,用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光,另一波長大于560nm的濾器檢測PI。采用Cell QUEST軟件進行采集分析。
7、細胞總RNA的提取及半定量RT-PCR檢測GLUT4、PI3K、A
13、KT/PKB、PPARr,LXRα、AMPK的表達誘導(dǎo)后的細胞處于80-90%融合狀態(tài)時用于實驗。PBS輕微沖洗2次后,細胞在無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育24小時后,25mmol/l葡萄糖濃度下,分組同前,各組分別干預(yù)后,棄去培養(yǎng)基,用PBS輕微沖洗2次后,加入冰預(yù)冷的Trizol1ml,采用一步法提取細胞總RNA。細胞總RNA提取;RNA純度及濃度測定;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):cDNA第一鏈合成(反轉(zhuǎn)錄);GLUT4、PI3K、AKT/P
14、KB、PPARγ、LXRα、AMPK的引物序列及反應(yīng)條件;制備3%瓊脂糖凝膠;電泳;測定電泳條帶密度值;掃描成像分析。
8、Western blot(免疫印記)檢測磷酸化AKT蛋白變化特點(24h)及檢測PAKT、PBad、Bcl-2、Bax蛋白的變化(48h)誘導(dǎo)后的細胞處于80-90%融合狀態(tài)時用于實驗。PBS輕微沖洗2次后,細胞在無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育24小時及48h后,25mmol/l葡萄糖濃度下,分
15、組同前,各組分別干預(yù)后收集細胞。蛋白收集及提取;蛋白質(zhì)濃度測定;SDS-PAGE電泳;轉(zhuǎn)膜;雜交;堿性磷酸酶顯色;掃描成像分析。
9、分光光度計檢測caspase-3活性收集實驗各組細胞(3×106/組),PBS洗二次,2000 r/min離心5 min,去除PBS,沉淀細胞中加入50μL冰冷裂解液和0.5μL DTT,吹打,冰上裂解60min,期間渦旋4次,每次10 s,4℃10000 r/min離心1min,吸取上清至
16、新管中置冰上,測蛋白濃度,各組采用同樣蛋白量進行實驗,加50μL2×ReactionBuffer/DTTMix及DEVD-fmk1mL,冰浴30 min,加5μL Ac-DEVD-pNA,37℃2h。分光光度計在405nm波長測定其吸光值,計算OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對照確定各組caspase-3活化程度。
10、統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行分析,結(jié)果用均數(shù)±標準差(x±s)表示,采用單因素方差分析比較組間差異,
17、P<0.05差異有顯著性。
結(jié)果:
1、不同葡萄糖濃度時,心肌細胞培養(yǎng)24小時3氚標記-葡萄糖(3H-G)及Ghrelin干預(yù)后攝取情況:與5.5mmol/l葡萄糖組比較,高糖組25.0mmol/l葡萄糖作用下3H-G攝取明顯降低(P<0.01)。Ghrelin10-8mol/L干預(yù)后,心肌細胞3H-G攝取有所升高(P>0.05);Ghrelin10-7mol/L干預(yù)后,心肌細胞3H-G攝取明顯升高(P<0.
18、05)。
2、流式細胞儀檢測H9C2細胞凋亡率:不同葡萄糖濃度及Ghrelin干預(yù)后心肌細胞培養(yǎng)48小時,與5.5mmol/l葡萄糖組比較,高糖組25.0mmol/l葡萄糖作用下心肌細胞凋亡率明顯增加;Ghrelin10-7mol/L干預(yù)后,心肌細胞凋亡率明顯降低。
3、RT-PCR檢測PI3K,PPARγ,LXRα,GLUT4和AMPK mRNA表達:PI3K,PPARγ,LXRα,GLUT4和AMPKmR
19、NA高糖組水平明顯降低(P<0.01或P<0.05);10-8mol/L Ghrelin作用下水平升高不明顯(P>0.05);10-7mol/LGhrelin作用下水平明顯升高(P<0.01或P<0.05);說明ghrelin在10-7mol/L濃度時具有升高PI3K,PPARγ,LXRα,GLUT4和AMPK mRNA表達的作用,而10-8mol/L濃度時該作用不明顯。
4、Western blot法檢測磷酸化PI3K\
20、AKT蛋白變化特點(心肌細胞培養(yǎng)24小時):高糖組PAKT水平明顯降低(P<0.01);10-8mol/L Ghrelin作用下,PAKT水平升高不明顯(P>0.05);10-7 mol/L Ghrelin作用下,PAKT水平明顯升高(P<0.01);說明ghrelin在10-7 mol/L濃度時具有升高PAKT蛋白表達的作用,而10-8 mol/L濃度時該作用不明顯。
5、Western blot法檢測PAKT、PBad
21、及Bcl2、Bax蛋白變化特點(心肌細胞培養(yǎng)48小時):高糖組PAKT、PBad及Bcl2明顯降低(P<0.01);10-8mol/L Ghrelin作用下,PAKT、PBad及Bcl2水平升高不明顯(P>0.05);10-7mol/L Ghrelin作用下,PAKT、PBad及Bcl2水平明顯升高(P<0.01);說明ghrelin在10-7mol/L濃度時具有升高PAKT、PBad及Bcl2蛋白表達的作用,而10-8 mol/L濃度
22、時該作用不明顯。免疫印跡法半定量Bax蛋白表達:高糖組Bax水平明顯升高(P<0.01);10-8mol/L Ghrelin作用下,Bax水平變化不明顯(P>0.05);10-7mol/L Ghrelin作用下,Bax水平下降(P<0.05);說明ghrelin在10-7mol/L濃度時具有降低Bax蛋白表達的作用,而10-8 mol/L濃度時該作用不明顯。
結(jié)論:
1、高糖對心肌細胞的直接傷害作用表現(xiàn)為抵抗
23、和凋亡并存。
2、Ghrelin干預(yù)后可以改善高糖引起的心肌細胞的胰島素抵抗;Ghrelin10-7mol/L可以防止心肌細胞的凋亡,故Ghrelin在高糖濃度下對心肌細胞有保護作用。
3、不同葡萄糖濃度下,Ghrelin改變了葡萄糖攝取的GLUT4 mRNA表達水平,Ghrelin通過GLUT4促進糖攝?。籊hrelin改變了AMPKmRNA的表達水平,說明AMPK在高糖毒性時參與了心肌細胞的葡萄糖攝取。<
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