融安金柑花器官發(fā)育轉(zhuǎn)錄特征分析及相關(guān)MADS box基因功能研究.pdf

1、金柑(Fortunella crassifolia Swingle)屬蕓香科金柑屬植物，與柑橘屬、枳屬同為蕓香科植物，但金柑開花與發(fā)育過程具有自身特點:金柑發(fā)育周期短，其在適宜條件一年可多次開花，當(dāng)年抽生枝梢即可開花，是研究柑橘成花和花發(fā)育的特色材料。本研究以廣西主產(chǎn)品種“融安”金柑為材料，通過高通量測序分析融安金柑花形態(tài)發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄特征，發(fā)現(xiàn)MADSbox家族基因在花器官發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用;通過同源克隆方法獲得37個融安金柑

2、MADS box基因序列信息，并進行了生物信息學(xué)分析和聚類分析;對這些MADS box基因進行半定量PCR與熒光定量PCR表達水平檢測分析，篩選得到12個特異調(diào)控花器官發(fā)育的關(guān)鍵基因;成功構(gòu)建6個融安金柑MADS box家族基因植物表達載體，將其中2個基因轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)化植株，并對其基因功能進行了初步分析和驗證;另外，為獲得較為準確的基因表達水平定量結(jié)果，對熒光定量內(nèi)參基因進行了篩選。本論文將為深入研究融安金柑花發(fā)育與調(diào)控機制奠定研

3、究基礎(chǔ)，具有一定的理論與應(yīng)用價值。論文主要獲得研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　1、融安金柑花轉(zhuǎn)錄組測序分析
　　通過對金柑花不同時期樣品顯微切片觀察，分析其在發(fā)育過程中的形態(tài)發(fā)生與分化特點，確定轉(zhuǎn)錄組測序分析及表達譜分析樣品。利用高通量測序技術(shù)對融安金柑花樣品轉(zhuǎn)錄組進行測序，拼接組裝后共獲得共88712條轉(zhuǎn)錄本、46361個unigene，對轉(zhuǎn)錄組中SNP與SSR分布特點進行了初步分析，對應(yīng)甜橙全基因組數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，確定本實

4、驗中的測序結(jié)果具備較好的代表性與可靠性，可以作為金柑花發(fā)育表達譜研究的參考序列。
　　2、融安金柑花發(fā)育過程表達譜分析
　　分析融安金柑花發(fā)育5個不同階段樣品的表達譜，通過計算獲得樣品間的差異表達基因，對其進行了GO功能聚類分析與KEGG代謝途徑聚類分析;并對融安金柑花發(fā)育過程基因轉(zhuǎn)錄特點進行了綜合分析，篩選獲得與花發(fā)育相關(guān)的激素、糖代謝、轉(zhuǎn)錄因子等關(guān)鍵調(diào)控途徑，同時發(fā)現(xiàn)MADSbox家族轉(zhuǎn)錄因子可能在花發(fā)育過程中有重要作用

5、。
　　3、融安金柑不同組織與非生物脅迫處理下基因表達定量內(nèi)參基因篩選
　　為獲得較準確的基因表達水平分析數(shù)據(jù)，運用Normfinder、geNorm、hkgFinder和Bestkeeper計算方法對不同組織與非生物脅迫實驗處理下的16個備選內(nèi)參基因進行篩選，發(fā)現(xiàn)ACT7在實驗許多處理情況下表達穩(wěn)定，適合作為融安金柑不同組織與多種非生物脅迫下的基因表達水平分析內(nèi)參基因，同時也可采用ACT1+ACT7+EF1-α和ACT1+

6、A CT8多基因復(fù)合形式作為基因表達水平分析內(nèi)部參照。
　　4、MADS box基因克隆、生物信息學(xué)及表達分析
　　通過同源克隆方法獲得融安金柑37個MADS box基因，對核苷酸序列及編碼蛋白進行生物信息學(xué)分析，聚類分析結(jié)果顯示37個基因分散于MADS box基因13個不同亞族類型中。
　　對融安金柑MADS box家族基因進一步重點研究，通過半定量檢測37個MADS box基因在不同組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)其中15個

7、基因與花發(fā)育調(diào)控直接相關(guān);進一步對其中12個基因進行熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)其表達模式各自均具有一定的表達特點，在融安金柑花發(fā)育調(diào)控過程中各自扮演多樣而重要的角色。
　　5、花發(fā)育相關(guān)MADS box基因轉(zhuǎn)化擬南芥功能驗證
　　選取表達強且功能可能較為重要的FcSEP1、FcSEP1-2、FcGLO、FcAGL11、FcDEFH21和FcAGL61-2構(gòu)建植物表達載體，F(xiàn)cSEP1-2與FcGLO兩個基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成功，獲得擬