山茶花MADS-box家族A類和C類基因克隆及功能分析.pdf

1、山茶花（Camellia japonica）是山茶屬（Camellia）的模式植物，該物種的許多品種花器官變異極其豐富，是我國(guó)傳統(tǒng)的十大名花之一。同時(shí)該物種還存在非常普遍的萼片瓣化和雄蕊瓣化的表型變異，這對(duì)于研究山茶花重瓣花形成的分子機(jī)理和起源方式均具有重要意義。分子植物育種可以縮短觀賞植物育種的周期，人為定向進(jìn)行新品種培育。根據(jù)花器官發(fā)育的“ABC”模型，A類和C類功能基因可在植物山茶重瓣花形成中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。研究A類和C類基因在

2、山茶重瓣花形成中的分子調(diào)控機(jī)理，將為山茶和其他觀賞植物的花型育種提供依據(jù)。
　　 采用同源克隆方法和RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技術(shù)，從山茶托桂型重瓣類栽培品種‘金盤荔枝'的發(fā)育早期花芽中分離到了山茶花花器官發(fā)育同源基因cDNA全長(zhǎng)，序列分析表明分別為A類的AP1同源基因CjAPL1(GenBank登錄號(hào)JX657332)和CjAPL2(GenBank登錄號(hào)JX843815)、AG

3、L6同源基因CjAGL6（GenBank登錄號(hào)JX657333），C類的AG類同源基因jAG1(GenBank登錄號(hào)JX843816)。生物信息學(xué)和保守域分析表明，克隆的4個(gè)基因皆為典型的TypeⅡ類型的MADS-box家族花器官發(fā)育調(diào)控基因。
　　 以六種典型花型的山茶原種和品種為材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量方法對(duì)山茶中獲得的4個(gè)基因的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行了研究。在時(shí)間表達(dá)模式中，隨著花芽發(fā)育成熟度的增加和花瓣數(shù)量的增多，CjAPL1和

4、CjAPL2基因的高表達(dá)趨勢(shì)表現(xiàn)為由花芽發(fā)育早期轉(zhuǎn)至中期，但在半重瓣品種的花芽發(fā)育中后期也進(jìn)行了高表達(dá)。CjAGL6基因在單瓣花型中的最高表達(dá)量是在花芽發(fā)育早期，隨花瓣數(shù)量增多高表達(dá)轉(zhuǎn)至發(fā)育中后期，但半重瓣品種的后期表達(dá)量最高。CjAG1基因除在半重瓣品種的花芽發(fā)育中期進(jìn)行了高表達(dá)外，在其他5種花型中普遍為花芽發(fā)育的后期表達(dá)量最高。
　　 在不同品種的山茶花器官中，CjAPL1基因在萼片或瓣化萼片、外輪花瓣中的表達(dá)量高于雄蕊和內(nèi)

5、輪花瓣，同時(shí)也在花柱、子房和瓣化雄蕊中存在高表達(dá)，表明CjAPL1基因不僅對(duì)萼片和外輪花瓣花器官調(diào)控功能比較明顯，而且對(duì)于花柱和子房也具有明顯的調(diào)控功能。CjAPL2基因與CjAPL1基因的表達(dá)模式相似，在山茶萼片、瓣化萼片、外輪花瓣和心皮中的表達(dá)量普遍高于內(nèi)輪花瓣和雄蕊，且在玫瑰重瓣型和完全重瓣型中該基因調(diào)控效果更加顯著。
　　 CjAGL6基因在單瓣型、半重瓣型和托桂型中的高表達(dá)集中于心皮、萼片或瓣化萼片部位，其次為內(nèi)輪的花

6、瓣、瓣化雄蕊和雄蕊;在其他3個(gè)品種中的高表達(dá)量部位為雄蕊和內(nèi)輪花瓣。
　　 CjAG1基因的表達(dá)量較一致，主要集中于心皮、雄蕊、瓣化雄蕊，且在內(nèi)輪花瓣和瓣化萼片中的總體表達(dá)量高于外輪花瓣;這說明CjAG1主要對(duì)內(nèi)輪花器官起調(diào)控作用。但在‘紅十八學(xué)士’中該基因?qū)τ趯?duì)于外輪花瓣和瓣化萼片的調(diào)控作用卻較內(nèi)輪花瓣明顯，顯示出山茶完全重瓣品種基因表達(dá)的特異性。
　　 利用酶切方法，分別構(gòu)建了4個(gè)正義植物表達(dá)載體和4個(gè)于擾植物表達(dá)載

7、體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法分別轉(zhuǎn)化擬南芥野生型、ap1-3和ag-1突變體植株。經(jīng)表型觀察統(tǒng)計(jì)，獲得了含CjAPL1、CjAPL2、CjAGL6和CjAG1正義基因的擬南芥野生型陽性植株分別為65株、42株、73株和102株;含CjAPL1、CjAGL6和CjAG1干擾基因的擬南芥陽性植株數(shù)量各45株、21株和25株:含CjAPL1正義基因的擬南芥ap1-3突變體和含CjAG1正義基因的擬南芥ag-1突變體陽性植株分別為36株和28

8、株。從每個(gè)轉(zhuǎn)基因表型為陽性類型的植株中隨機(jī)挑選3株，經(jīng)基因組PCR擴(kuò)增和Southern雜交鑒定確認(rèn)為陽性轉(zhuǎn)基因植株，熒光定量結(jié)果表明，與對(duì)照相比較，所有目的基因在轉(zhuǎn)正義和干擾基因的陽性植株中分別出現(xiàn)相應(yīng)表達(dá)量顯著升高和下降的結(jié)果。
　　 經(jīng)表型觀察統(tǒng)計(jì)，轉(zhuǎn)CjAPL1和CjAPL2基因擬南芥野生型植株典型的表型變異為:萼片邊緣演變?yōu)榛ò曩|(zhì)地的白色，花內(nèi)都出現(xiàn)花柱增加1枚，但雄蕊數(shù)量前者增加4枚，后者2-3枚;此外，轉(zhuǎn)CjAPL

9、2的植株單朵花花徑變大，花瓣增加i-3枚，萼片數(shù)量不變或減少1枚。CjAPL2還能夠促進(jìn)花瓣形成，且這兩個(gè)基因還可以調(diào)控內(nèi)輪雌、雄蕊的器官數(shù)量增加。轉(zhuǎn)CjAGL6正義基因的植株雄蕊和雌蕊數(shù)量保持不變，但萼片增加1枚，花瓣數(shù)量和形態(tài)沒有發(fā)生變化。轉(zhuǎn)CjAG1正義基因的植株單朵花花徑縮小明顯，雄蕊增多2-4枚，萼片先端出現(xiàn)柱頭狀乳突，花瓣數(shù)量減少甚至無花瓣發(fā)育，雌蕊數(shù)量沒有變化。
　　 觀察到轉(zhuǎn)CjAPL1和CjAG1干擾基因的陽性

10、植株都出現(xiàn)雄蕊減少1-2枚的表型;轉(zhuǎn)CjAGL6干擾基因的花徑變大，雄蕊退化，花柱為1枚且上部分彎曲，萼片和花瓣各發(fā)育為3枚、內(nèi)彎，花瓣外表面的上半部分顏色變紅，表明所干擾的基因有調(diào)控萼片、花瓣和花柱生長(zhǎng)及伸長(zhǎng)的功能;雄蕊退化也表明CjAGL6對(duì)于花器官的形態(tài)和數(shù)量發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。
　　 在正義表達(dá)載體轉(zhuǎn)擬南芥突變體實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)山茶CjAPL1正義基因的擬南芥ap1-3突變體，花序恢復(fù)為總狀花序，單花花徑變大，花瓣數(shù)量也恢

11、復(fù)為4枚;同時(shí)，株型也得到恢復(fù)。通過轉(zhuǎn)擬南芥ap1-3突變體的花瓣數(shù)量增加，再次表明CjAPL1基因有增加花瓣數(shù)量的調(diào)控功能。轉(zhuǎn)山茶CjAG1正義基因的擬南芥ag-1突變體，雄蕊數(shù)量也恢復(fù)為6枚，這也證實(shí)了CjAG1基因具有調(diào)控雄蕊數(shù)量增加的功能。
　　 綜合熒光定量、模式植物功能驗(yàn)證和表型觀察統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，認(rèn)為山茶重瓣花的起源方式可能包括萼片起源、雄蕊起源和重復(fù)起源等多種，且這些起源方式對(duì)于不同花型重瓣花形成的作用是不同的。半

12、重瓣型品種的重瓣性為單一的萼片起源;牡丹重瓣型品種重瓣性為雄蕊起源為主，雄蕊起源和萼片起源并存;托桂型品種中重復(fù)起源與雄蕊起源并存，輔以萼片起源。玫瑰重瓣型和完全重瓣型山茶品種重瓣性以重復(fù)起源作為主要的重瓣花起源方式，輔以雄蕊起源和萼片起源。
　　 本研究表明，山茶CjAPL1、CjAPL2基因不僅能促進(jìn)萼片向花瓣屬性的轉(zhuǎn)化，而且可以調(diào)控花瓣和雄蕊、雌蕊的數(shù)量增加;CjAGL6基因能夠調(diào)控雄蕊數(shù)量，同時(shí)促進(jìn)增萼片和花瓣數(shù)量增多;