水稻類病變spl5基因的精細定位和山茶花RAPD反應(yīng)體系的研究.pdf

1、類病變(lesion mimic)是指植物在沒有明顯的逆境、損傷或病原物侵害時，就能在葉片上自發(fā)地形成壞死斑(lesion)，其癥狀與某種病原物侵染的壞死癥狀非常類似的現(xiàn)象。植物類病變是目前植物生理學(xué)、分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)等領(lǐng)域研究的一個熱點，對了解植物細胞發(fā)育與凋亡、植物抗病與抗逆防衛(wèi)系統(tǒng)等具有重要意義。 水稻類病變spl5突變體是由粳稻(Oryza sativa L.ssp．Japonica)品種Norin8經(jīng)γ射線輻射誘

2、導(dǎo)而成，該突變體在大田、人工氣候箱以及無菌條件下均能表現(xiàn)出明顯的褐色壞死斑，屬于自發(fā)型、全生育期的類病變。經(jīng)錐蟲藍、DAB和苯胺藍染色，證明spl5病斑葉中細胞正在死亡，并有H<,2>O<,2>、胼胝質(zhì)等物質(zhì)的積累，推測spl5細胞壞死可能與超敏反應(yīng)導(dǎo)致的氧進發(fā)有關(guān)。研究還初步表明光照與高溫都能促進spl5葉片的病斑發(fā)生；spl5的種子發(fā)芽易受到高溫的抑制，植株生長較緩慢且植株矮??；spl5突變體對白葉枯病(Xanthomonas or

3、yzae pv．oryzae)的三個生理小種PXO61、PXO112和PXO145有一定的抗性。Iwata等(1978)研究表明spl5類病變是由單個隱性基因控制，并利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記將spl5基因確定在水稻7號染色體30cM處。 本研究用經(jīng)典遺傳圖譜上的SSR標(biāo)記對spl5基因進行連鎖分析，將該基因初步定位在RM6574和RM8247兩個標(biāo)記之間，兩者的遺傳距離為3.3cM。根據(jù)水稻日本晴基因組序列設(shè)計了65個新的STS標(biāo)記，利用

4、spl5與9311雜交F2群體，將該基因更精細地定位于兩個標(biāo)記SSR41和RM7121之間，兩個標(biāo)記之間的物理距離為134kb，該區(qū)域共預(yù)測到33個ORF。以上這些工作為今后spl5基因的克隆與功能分析奠定了堅實的基礎(chǔ)。 山茶花(Camellia japonica L.)是我國特產(chǎn)的名貴花卉之一，由于其品種繁多，在品種的分類、鑒定上存在一定的難度。對山茶花的DNA提取方法和RAPD擴增體系進行研究，可以為山茶花DNA分子水平的分

5、類鑒定打下一定基礎(chǔ)。實驗采用改進的CTAB法，即在DNA提取液中加入4％β-巰基乙醇和2％PVP，提取得到山茶花葉片的DNA純度較高、片段完整性較好，符合分子遺傳實驗的要求。在山茶花RAPD擴增條件的研究中，表明20μL反應(yīng)體系中加入100ng DNA、125μMdNTP(each)、1.2mM Mg<'2+>、1×Buffer、0.5μM引物、1U Taq酶最為合適，退火溫度一般設(shè)為37℃左右，擴增產(chǎn)物的電泳條帶數(shù)多、清晰、明亮。利用