宮頸鱗癌前驅病變的克隆性及HPV16E6基因整合和P16表達的研究.pdf

1、背景：宮頸癌是世界范圍內威脅女性生命的第二大惡性腫瘤。近年來，我國宮頸癌發(fā)病率呈上升趨勢，發(fā)病年齡趨于年輕化。宮頸癌的發(fā)生是多基因參與的多步驟的病理過程，其前驅病變稱為宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)，包含CIN I、CINII、CINIII(含原位癌)。CIN的發(fā)生與進展存在著很多不確定因素，且臨床表現(xiàn)多樣性： (1)CIN I(低級別)中有20％病例可進展為CIN

2、II/Ill(高級別)，50％-60％的可自發(fā)性消退；而40％-50％的CIN II/III可進展為浸潤癌。但細胞學和組織學難以鑒別自發(fā)性消退或發(fā)展為浸潤癌的病變。 (2)宮頸癌的發(fā)生與高危HPV感染有關。盡管大多數(shù)C1N患者有HPV感染，但僅有少數(shù)病例可發(fā)展為浸潤癌。因此，緊密結合CIN病理診斷和臨床治療需要，評價促進CIN發(fā)生與進展的風險因子，使CIN分級更符合其生物學行為，以提高對CIN患者治療的合理性、治愈率和生活質量，防

3、止對CIN過度治療或治療不足，對實現(xiàn)宮頸癌的早期防治具有重要意義。目的：研究CIN的克隆性特征及人乳頭瘤病毒HPVl6(human papillomaviroustypel6,HPVl6)E6基因整合狀態(tài)和P16蛋白表達情況，探討這些分子變化與CIN病理分級的相關性及其意義。 方法：從同濟大學附屬東方醫(yī)院病理科存檔的2000-2005年活檢或手術切除的宮頸標本中，隨機選取150例，其中CIN I 33例，CINIl38例，CIN

4、III34例，宮頸鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)45例。另選取非宮頸病變切除的宮頸組織20例為對照組。所有標本經(jīng)4％中性甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，單個位點顯微切割病變組織及其間質，常規(guī)方法抽提基因組DNA。 (1)巢式PCR擴增位于人類X染色體上的.AR基因，PAGE電泳檢測病變的克隆性。 (2)以通用引物GP5＋/GP6＋擴增HPVL1區(qū)；多重PCR同時擴增HPVl6的E2、E6

5、基因，分析HPVl6的存在狀態(tài)。HPVl6 E2或E6陽性提示HPVl6感染，HPVl6 E2/E6比值接近或大于1，為}tPVl6游離型；HPVl6E2/E6比值明顯小于1，為HPVl6游離、整合混合型；僅為HPVl6 E6陽性，為}tPVl6E6完全整合型。 (3)免疫組織化學(Envision法)檢測P16在CIN的表達，分析其分布特征。 (4)采用SAS8.0軟件進行統(tǒng)計分析。結果：本組150例樣本中，成功擴增1

6、39例，其中純合子12例，雜合子127例，雜合率91.4％。 結果： (1)各組病變單克隆率：對照組為0例、CINI組為26.9％(7/26)、CIN II組為51.5％(17/33)、CINⅢ組為82.1％(23/28)、SCC組為85.0％(34/40)，單克隆率隨CIN病變級別增高而增加(X2=16.492，P=0.0003)。 (2)各組HPVl6陽性病變分別為：對照組2例、CIN I組8例、CINII

7、組13例、CINⅢ14例和SCC組29例；其中HPVl6E6的整合率分別為：正常組為0、CIN I組25％(2/8)、CIN II組30.8％(5/13)、C1NⅢ組64.3％(9/14)、SCC組79.3％(23/29)，HPVl6E6基因在各級CIN中的整合率不同，其差別有統(tǒng)計學意義X2=6.747，P=0.034)。HPVl6E6基因整合與CIN的單克隆性呈正相關(X2=7.768，P=0.0053，r=0.36)(3)P16在C

8、IN病變中表達程度不一，在CIN I、CINII和CINⅢ中的陽性率分別為69.2％(18/26)、87.9％(29/33)和92.9％(26/28)，其差別有顯著統(tǒng)計學意義(X2=20.1，P<0.0001)。其中CIN I組有50％(13、26)的病變?yōu)镻16陽性細胞的局灶分布，CIN II組有42.5％(14/33)的病變?yōu)镻16陽性細胞在上皮基底旁連續(xù)分布，而CINⅢ組67.9％(19/28)的病變中P16陽性細胞在上皮全層彌漫

9、分布，該分布特征差別有統(tǒng)計學意義(X2=21.996，P<0.001)。SCC組P16陽性率為97.5％(9/40)，其中90％(36/40)為P16彌漫陽性。相關分析表明P16在各級CIN中的分布特征與HPVl6的整合有關(X2=4.36，P=0.037，r=0.37)。 結論： (1)單點顯微切割克隆性分析結果表明，本組病例中少部分CIN I、絕大部分CINII/Ill是單克隆性病變；發(fā)現(xiàn)單克隆性特征與CIN分級密切

10、相關，隨著CIN由低級別向高級別CIN進展，單克隆性的發(fā)生頻率增加，提示單克隆性CIN具有腫瘤屬性。 (2)HPVl6E6基因整合與CIN分級相關，提示HPVl6病毒癌基因的整合參與CIN的發(fā)生與進展，是宮頸SCC早期發(fā)生的關鍵步驟。 (3)P16在C1N中表達增高，且呈不同的分布特征，與CIN的分級相關；P16陽性細胞的分布特征與HPVl6的整合密切相關，提示P16是對CIN分級和宮頸鱗癌前驅病變生物學評價的有效標志物