AECOPD患者病情嚴(yán)重程度與TNF-a、Il-10、RANTES水平的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種常見而又嚴(yán)重危害人類健康的呼吸系統(tǒng)疾病，以氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展且不完全可逆為特征，是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率增加的主要原因之一，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)，這種情況日益加重[1]。目前臨床上尚缺乏能夠適時(shí)、準(zhǔn)確評估AECOPD(acute exacerbation of COPD)的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的指標(biāo)，研究能夠判斷AE

2、COPD發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的敏感指標(biāo)具有重要意義。感染是COPD發(fā)生發(fā)展的重要因素。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以通過刺激機(jī)體各種免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞炎癥介質(zhì)，引起機(jī)體的一系列炎癥反應(yīng)。P38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要激酶，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在LPS導(dǎo)致的炎癥瀑布反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[2]。p38MAPK抑制劑SB203

3、580可抑制LPS所致肺部的炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以健康人和AECOPD病人血清及外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)為研究對象，觀察健康對照組及不同程度AECOPD患者血清中TNF-a、IL-10、RANTES的水平及SB203580對LPS誘導(dǎo)的PBMCs分泌TNF-a、IL-10、RANTES水平的影響。探討AECOPD病情嚴(yán)重程度與細(xì)胞因子TNF-a、IL-10、RANTES

4、的相關(guān)性，為臨床預(yù)防、治療AECOPD提供新的思路。
　　 方法:
　　 1、研究對象:選擇2012年3月-2013年1月我院呼吸內(nèi)一科住院的AECOPD患者及同期門診體檢證實(shí)的健康志愿者。按2011年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸分會(huì)制定的COPD及急性加重期的診斷標(biāo)準(zhǔn)分為:(1)AECOPD組;(2)健康對照組。根據(jù)FEV1/FVC、FEV1％預(yù)計(jì)值和臨床表現(xiàn)將AECOPD組進(jìn)一步分為Ⅱ級（中度組）(50％≤FEV1％＜80％)，Ⅲ

5、級（重度組）(50％＜FEV1％≤30％)，Ⅳ級（極重度組）(FEV1％＜30％)。實(shí)驗(yàn)分組共4組:（D健康對照組;②AECOPD中度組;③AECOPD重度組;④AECOPD極重度組。
　　 2、血清及PBMCs細(xì)胞上清TNF-a、IL-10、RANTES水平測定
　　 2.1、標(biāo)本采集:所有入選的對照組及實(shí)驗(yàn)組(AECOPD患者)于清晨空腹采肘靜脈血8ml，其中3ml注入干燥的真空非抗凝管中，以4℃3000r/min離

6、心15min，吸取上清液至于EP管，于-80℃冰箱內(nèi)保存，待測TNF-a、IL-10、RANTES的水平。另5ml血注入EDTA抗凝管中，用于PBMCs的分離。
　　 2.2、分離單個(gè)核細(xì)胞:用淋巴細(xì)胞分離液分離出每份血液中的單個(gè)核細(xì)胞。0.4％臺(tái)盼藍(lán)染色，排除無活性的細(xì)胞，活性細(xì)胞數(shù)＞95％可采用。用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度均為1×106/ml，備用。
　　 2.3、ELISA法測定血清中T

7、NF-a、IL-10、RANTES濃度。
　　 2.4、ELISA法測定PBMCs細(xì)胞上清中TNF-a、IL-10、RANTES的含量變化。
　　 3、實(shí)驗(yàn)分組:首先將分別將各組分離的PBMCs計(jì)數(shù)后用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度到1×106/ml，于24孔板中孵育(37℃CO2孵箱中)，實(shí)驗(yàn)共分5組。
　　 3.1、對照組:加入與實(shí)驗(yàn)組等體積無血清RPMI1640培養(yǎng)液;
　　

8、3.2、LPS組:終濃度1ug/mlLPS，刺激90min;
　　 3.3、LPS+SB5組:加入終濃度5μMSB203580，1小時(shí)后加入終濃度1ug/mlLPS，刺激90min;
　　 3.4、LPS+SB10組:加入終濃度10μMSB203580，1小時(shí)后加入終濃度1ug/mlLPS，刺激90min;
　　 3.5、LPS+SB15組:加入終濃度15μMSB203580，1小時(shí)后加入終濃度1ug/mlLPS

9、，刺激90min。
　　 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞刺激成功后，離心(1500r/min，4℃，10min)，收集細(xì)胞上清液。保存細(xì)胞上清液于-80℃冰箱內(nèi)。ELISA法測定細(xì)胞上清中TNF-a、IL-10、RANTES的含量。
　　 結(jié)果:
　　 1、健康對照組及AECOPD患者血清細(xì)胞因子水平:(1)AECOPD患者三組之間血清TNF-a水平比較:重度組高于中度組(P＜0.05)，極重度組高于重度組(P＜0.05);AEC

10、OPD患者與健康對照組血清TNF-a水平比較:均明顯高于對照組（P＜0.05）。(2)AECOPD三組之間血清RANTES水平比較:重度組、極重度組均高于中度組(P＜0.05);AECOPD患者中度組、重度組、極重度組血清RANTES水平均明顯高于對照組(P＜0.05)。(3)AECOPD患者中度組、重度組、極重度組血清IL-10水平均明顯低于對照組(P＜0.01);AECOPD患者三組之間血清IL-10水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)

11、。(4)AECOPD患者血清TNF-a、RANTES水平與FEV1％呈負(fù)相關(guān)(r=-0.957，P=0.00;r=-0.964，P=0.00);IL-10水平與FEV1％呈正相關(guān)(r=0.656，P=0.00)。
　　 2、PBMCs上清細(xì)胞因子水平:(1)比較健康組及AECOPD中度組、重度組、極重度組PBMCs體外相同條件（加入等體積無血清RPMI1640）下分泌TNF-a、RANTES、IL-10的水平:細(xì)胞上清中IL-1

12、0含量比較:健康對照組高于AECOPD中度組(P＜0.05)，中度組高于重度組（P＜0.05），重度組高于極重度組(P＜0.05);細(xì)胞上清中TNF-a含量比較:中度組高于健康對照組(P＜0.05)，重度組高于中度組(P＜0.05)，極重度組高于重度組（P＜0.05）;細(xì)胞上清中RANTES含量比較:AECOPD極重度組細(xì)胞上清中RANTES含量高于健康組、中度組、重度組(P＜0.05)，健康組與AECOPD中度組、重度組比較比細(xì)胞上清

13、中RANTES含量無明顯差異(P＞0.05)，AECOPD中度組與重度組之間無顯著差異(P＞0.05)。(2)體外不同刺激后比較PBMCs細(xì)胞上清中TNF-a、RANTES、IL-10含量:LPS刺激PBMCs后，健康組及AECOPD三組細(xì)胞上清液中TNF-a、RANTES含量較對照組增加（P＜0.05），而IL-10較對照組含量減低(P＜0.05);健康人細(xì)胞上清中TNF-a、RANTES、IL-10含量:IL-10含量隨SB2035

14、80處理濃度增加而增加均高于LPS組(P＜0.05)，AECOPD三組中SB203580(5μM、10μM和15μM)預(yù)處理抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-a、RANTES含量增加(P＜0.05)，但I(xiàn)L-10含量隨SB203580預(yù)處理濃度增加而略增加，AECOPD三組之間比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。各組用單因素方差分析(OnewayANOVA)進(jìn)行比較。如有顯著性用Student-N

15、ewman-Keuls(SNK-q)檢驗(yàn)，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、血清中TNF-a、RANTES與AECOPD病情嚴(yán)重程度正相關(guān)，與肺功能呈負(fù)相關(guān);IL-10水平與AECOPD病情嚴(yán)重程度負(fù)相關(guān)，與肺功能正相關(guān)?？梢奣NF-a、RANTES在COPD發(fā)生、發(fā)展中參與了氣道炎癥反應(yīng)，可能是COPD急性加重的重要指標(biāo)，IL-10則發(fā)揮一定的抗炎作用。
　　 2、對照組與實(shí)驗(yàn)組LPS刺激