糖耐量受損對心肌功能的影響及其機制研究.pdf

1、背景與目的
　　 糖耐量受損(impaired glucose tolerance,IGT)是糖尿病前期(pr-diabetes)狀態(tài)主要表現(xiàn),是糖尿病病前的一種過渡狀態(tài),各種類型糖尿病的一個關(guān)鍵發(fā)展階段。糖耐量受損能破壞體內(nèi)糖代謝平衡,成為Ⅱ型糖尿病和增加心血管疾病風(fēng)險的一個重要誘因。心肌功能降低是糖耐量受損階段中發(fā)生的心血管損傷之一。同時長期炎癥狀態(tài)并伴隨炎性細胞因子的異常表達,增加糖耐量受損發(fā)展階段心血管并發(fā)癥風(fēng)險。糖尿病

2、.心血管疾病.炎癥之間的關(guān)系復(fù)雜,闡明其相互作用對于代謝性心肌功能損傷的防治具有重要的臨床意義。
　　 巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)作為一個重要的促炎因子,在心血管疾病和糖尿病等疾病患者相關(guān)組織中表達異常增加,而在代謝性心肌病(metabolic cardiomyopathy)發(fā)病機制中是否發(fā)揮調(diào)節(jié)作用有待深入研究。已知G蛋白偶聯(lián)受體激酶-2(G p

3、rotein coupled-receptor kinase 2,GRK2)是心肌病變的早期標(biāo)記分子,c-jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號通路與細胞凋亡和慢性炎癥相關(guān)。因此揭示MIF與GRK2、JNK之間的關(guān)系,能初步闡明糖尿病前期糖耐量受損狀態(tài)心肌功能降低的病理生理學(xué)調(diào)節(jié)機制。
　　 本研究在建立糖耐量受損大鼠模型的基礎(chǔ)上,探討糖耐量受損狀態(tài)對大鼠的心肌功能、糖代謝、炎癥因子以及凋

4、亡相關(guān)信號通路的影響；同時以高濃度葡萄糖模擬糖耐量受損的餐后高血糖因素,建立高濃度葡萄糖條件心肌凋亡模型。通過體外細胞實驗驗證糖耐量受損的高血糖因素致心肌細胞凋亡作用,并探討MIF是否參與此凋亡過程,以及MIF與GRK2、JNK之間的可能調(diào)控形式。
　　 方法
　　 利用低劑量鏈脲霉素(20 mg/kg)誘導(dǎo)建立糖耐量受損大鼠模型,0、2、4、6 wk進行大鼠空腹血糖測定和口服糖耐量試驗,計算餐后血糖水平曲線下面積,評價

5、大鼠的糖耐量水平；實驗6wk,利用超聲心動圖測定各組大鼠左室射血分數(shù)和左室收縮分數(shù)等主要指標(biāo),反映心肌功能情況。6wk后,處死各組大鼠,制作心肌組織石蠟切片或提取心肌組織總蛋白。石蠟切片以糖原過碘酸雪夫堿PAS染色,光學(xué)顯微鏡觀察心肌糖原或糖基化物質(zhì)沉積情況；同時石蠟切片以末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記染色,光學(xué)顯微鏡觀察分析糖耐量受損狀態(tài)的致凋亡情況；以western blotting檢測caspase-3分解活性片

6、段、炎癥因子MIF、心肌功能異常標(biāo)記分子GRK2和磷酸化JNK在心肌組織的表達情況。
　　 體外實驗部分中,25mM D-葡萄糖作為高濃度糖實驗誘導(dǎo)條件,模擬糖耐量受損狀態(tài)的餐后高糖血癥病理條件,建立心肌細胞凋亡模型,而5mM D-葡萄糖作為正常對照組或心肌細胞基礎(chǔ)代謝的本底對照。以人源性成心肌細胞株AC16作為主要的實驗研究對象。實驗時以低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細胞,然后正常組和實驗組分別加入葡萄糖原液,使葡萄糖終濃度分別為

7、5和25 mM。
　　 通過熒光顯微鏡觀察,以DCFH-DA熒光探針檢測心肌細胞的胞內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生水平,評價高濃度葡萄糖的氧化應(yīng)激壓力作用,同時以JC-1熒光探針檢測心肌細胞線粒體膜電位,評價高濃度葡萄糖的促凋亡作用,并以此作為高濃度葡萄糖氧化應(yīng)激和致凋亡作用的定性分析。
　　 為了模擬和驗證糖耐量受損狀態(tài)的餐后高糖血癥對MIF、GRK2和JNK的直接調(diào)控作用,AC16細胞加入25 mM高濃度葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)20、30和

8、60 min后,然后經(jīng)蛋白裂解液裂解,提取總蛋白,通過western blotting檢測MIF、GRK2蛋白表達和JNK磷酸化水平；同時25 mM高濃度葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)AC16細胞60 min時,以TRIZOL裂解細胞,提取總RNA,并以realtime-PCR檢測MIF和GRK2 mRNA表達水平。
　　 AC16細胞以JNK磷酸化抑制劑-SP600125(2.5 μM)、MIF互變異構(gòu)酶活性拮抗劑-ISO-1(40 μM)

9、或二甲亞砜(DMSO:0.1％)預(yù)處理1 h,然后以25mM高濃度葡萄糖條件培養(yǎng)72h,以明確MIF和JNK在高濃度葡萄糖誘導(dǎo)心肌細胞凋亡過程中的作用。細胞經(jīng)胰酶消化后進行AnnexinV-FITC/PI雙染色-流式細胞儀檢測細胞熒光強度,數(shù)據(jù)通過處理,在二維圖右下象限中計算細胞早期凋亡率；或經(jīng)細胞蛋白裂解液裂解,提取總蛋白,以western blotting檢測caspaSe-3活性分解片段。
　　 以SP600125作為抑制

10、JNK磷酸化活性的陽性對照,利用ISO-1抑制MIF互變異構(gòu)酶活性,明確心肌細胞在高濃度葡萄糖條件下內(nèi)源性MIF對JNK磷酸化活性的調(diào)控作用；AC16細胞以SP600125、ISO-1或二甲亞砜預(yù)處理1 h后,以25 mM高濃度葡萄糖條件培養(yǎng)30、60 min,然后以細胞全蛋白裂解液(含磷酸酶抑制劑)裂解細胞,以western blotting檢測JNK磷酸化水平。同時利用ISO-1明確心肌細胞在高濃度葡萄糖條件下MIF互變異構(gòu)酶活性對

11、GRK2表達的調(diào)控作用,AC16細胞以ISO-1或二甲亞砜預(yù)處理1h后,以25 mM高濃度葡萄糖條件培養(yǎng)60 min,然后裂解細胞,提取總蛋白,western blotting檢測GRK2表達。
　　 結(jié)果
　　 大鼠經(jīng)鏈脲霉素注射后,在各時間點空腹血糖水平與正常組之間差異不顯著。2、4、6 wk的口服糖耐量試驗中,模型組大鼠開始出現(xiàn)糖耐量異常,其中血糖水平曲線下面積比正常對照組高,兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)以往報道糖

12、尿病前期狀態(tài)糖耐量受損的血糖水平曲線下面積特征(比正常組高15-40％),在0、2、4、6 wk模型組大鼠血糖水平曲線下面積分別增加2.50％、16.28％、38.60％和38.61％,因此它們可以認為發(fā)生糖耐量受損。
　　 另外模型組和正常組超聲心動圖指標(biāo)左室射血分數(shù)和左室收縮分數(shù)分別為68.59±6.62％Vs 81.40±5.34％(t=4.020,p=0.002)、33.74±4.91％vs 44.60±5.11％(t=

13、3.941,p=0.002),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,因此糖耐量受損的大鼠出現(xiàn)心肌功能降低。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記染色和caspase-3western blotting檢測,表明糖耐量受損狀態(tài)的大鼠出現(xiàn)凋亡心肌細胞。同時糖原過碘酸雪夫堿PAS染色顯示糖原或糖基化物質(zhì)沉積在糖耐量受損大鼠的心肌組織,其中在血管周圍組織的沉積明顯。這些說明糖耐量受損具有一定的心臟糖毒性作用。另外,糖耐量受損大鼠的心肌組織中炎癥因子-M

14、IF和心肌病變標(biāo)記分子-GRK2表達水平增加,JNK 通路激活。
　　 體外實驗部分中,DCFH-DA熒光探針顯示心肌細胞在高濃度葡萄糖作用下,胞內(nèi)活性氧簇在24h開始明顯增強,表明高濃度葡萄糖具有強的氧化應(yīng)激作用；同時JC-1探針熒光顯示高濃度葡萄糖降低心肌細胞內(nèi)線粒體膜電位,能觸發(fā)心肌細胞凋亡。另外,高濃度葡萄糖促進AC16心肌細胞MIF、GRK2表達和JNK磷酸化水平增加。這與動物實驗部分結(jié)果吻合,說明高濃度葡萄糖致心肌凋

15、亡模型可以用于驗證糖耐量受損高血糖因素的心臟糖毒性作用。高濃度葡萄糖同時促進MIF和GRK2 mRNA表達水平增加。
　　 高濃度葡萄糖誘導(dǎo)AC16心肌細胞72 h凋亡率為11.536±1.442％,而經(jīng)過SP600125或ISO-1預(yù)處理后,.AC16心肌細胞凋亡率分別下降至6.116±0.337％和5.776±1.217％(F=53.347,P<0.001),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。高濃度葡萄糖作用72 h能激活A(yù)C16心肌細

16、胞caspase 3,而經(jīng)過SP600125或ISO-1預(yù)處理均使AC16心肌細胞caspase 3活化分解片段表達降低(F=20.169,P<0.001),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明高濃度葡萄糖可以通過MIF的互變異構(gòu)酶活性和JNK磷酸化途徑介導(dǎo)AC16心肌細胞凋亡。
　　 結(jié)論
　　 低劑量鏈脲霉素可建立糖耐量受損大鼠模型。糖耐量受損引起大鼠心肌功能降低和糖代謝異常,同時心肌組織存在炎癥和凋亡細胞,表明糖耐量受損具

17、有一定的心臟糖毒性作用。
　　 高濃度葡萄糖誘導(dǎo)心肌細胞凋亡,能在一定程度說明糖耐量受損大鼠模型心肌功能降低的機制?；铙w實驗中Caspase-3、MIF和磷酸化JNK的異常表達在體外心肌細胞實驗得到驗證,可能參與了心肌功能降低的病理過程,GRK2的表達能作為糖耐量受損心肌功能降低的監(jiān)測指標(biāo)。MIF的互變異構(gòu)酶活性在高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡、GRK2表達和JNK磷酸化中具有重要的調(diào)控作用。因此MIF可能是代謝性心肌病的一個關(guān)