白芨膠載外源性rhEGF促進傷口愈合的實驗研究.pdf

1、目的：用中藥白芨膠(BSG)作為外源性表皮生長因子(EGF)的載體，應(yīng)用免疫組化、羥脯氨酸堿水解和流式細胞等多種檢測方法，觀察其對兔背部傷口愈合的影響，并探討其機制。 方法: 1.實驗動物：健康家兔40只，體重2.5-3kg，雌雄各半，編號。 2.藥品的制備2.1BSG的制備：將白芨制成干粉，用100ml蒸餾水將10g干粉攪拌混勻成粘稠膠狀物，高壓消毒，冷卻備用Ⅲ。2.2EGF的制備：在嚴格無菌操作下，用100m

2、l蒸餾水將1mgEGF凍干粉稀釋成濃度為10ug/ml藥液。 2.3EGF+BSG的制備：取白芨干粉10g，在嚴格無菌操作下，將其加入已配備好的100mlEGF藥液內(nèi)混勻，既為制備的BSG+EGF。 3.動物分組：將家兔隨機分為五組，即空白組(SW組)、實驗組1(BSG組)、實驗組2(EGF組)和實驗組3(BSG+EGF組)，每組均為10只，組內(nèi)再隨機分為5個亞組，即術(shù)后第3、5、7、10天組和傷口自然愈合組。

3、4.傷口制備方法[14]：以手術(shù)切割方法造模，背部以8％硫化鈉脫毛備皮，腹腔注射2％戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉，距脊柱正中旁開2cm處做皮膚全層切口，面積約2cm×2cm,共6個，左右各3個，創(chuàng)面之間的間隔約2cm。 5.給藥方法：用已配備好的藥液浸透雙層紗布覆蓋創(chuàng)面，再蓋以凡士林油紗，無菌紗布包扎，四頭繃帶固定，每日換藥一次。 6.取材：四組家兔在術(shù)后第3、5、7、10天分別于傷口處距邊緣約0.2cm取全厚皮膚組

4、織。所取組織中部分用4％多聚甲醛及時固定，4℃保存待做石蠟切片及HE、Masson和免疫組化染色，部分在-70℃條件下冰凍保存至生化檢測，部分用70％酒精及時固定，4℃保存待做流式細胞檢測。 7.觀測指標: 7.1傷口愈合時間的觀察：傷口愈合標準以創(chuàng)面面積小于總面積的5％或愈合面積大于95％為完全愈合。 7.2傷口愈合率的觀察：各組動物分別在傷后第3、5、7、10、14天，用0.25cm×0.25cm的透明方格紙

5、測定傷口面積，用德國產(chǎn)ASM-68K半自動圖象分析儀計算傷口面積，傷口愈合速率=愈合面積/原傷口面積。 7.3羥脯氨酸含量測定：依照羥脯氨酸試劑盒說明書步驟，測定所取的第3、5、7、10天的皮膚組織中的羥脯氨酸含量。 7.4表皮細胞增殖活性測定：用流式細胞檢測方法檢測術(shù)后第5天表皮細胞DNA的含量及周期變化。 7.5圖象分析方法：對免疫組化染色切片，光鏡觀察血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)分布部位和表達。采用Moti

6、cMed6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)進行定量分析，每組選4張切片，每張切片選取有代表性區(qū)域，隨機取互不重疊的5個200倍視野，以光密度200為背底，彩色攝象機取圖，測量平均光密度和積分光密度值并用計算機進行統(tǒng)計學(xué)處理。 7.6光鏡組織學(xué)觀察：經(jīng)HE和Masson染色后，通過光鏡觀察術(shù)后第3和第10天皮膚組織中新生毛細血管，膠原纖維和細胞滲出的變化。 8.統(tǒng)計學(xué)處理：用SAS6.12統(tǒng)計學(xué)處理軟件，對各種數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。