海洋生物膠原蛋白和靜電紡絲膜促進傷口愈合作用研究.pdf

1、膠原蛋白具有優(yōu)良的物理機械性能、良好的生物相容性、安全性和低免疫原性，能促進細胞粘附和增殖，促使血管形成、肉芽生長和上皮化，加快傷口愈合的進度，能作為優(yōu)良的生物材料。通過靜電紡絲技術制備膠原蛋白靜電紡絲膜，同時具備膠原蛋白優(yōu)良的生物學性能和靜電紡絲納米纖維高比表面積、高孔隙率、孔道連通性、三維結構和仿生天然細胞外基質的優(yōu)點，有望成為優(yōu)異的生物醫(yī)學組織工程材料。評價生物醫(yī)學組織工程材料的功效作用是開展臨床前研究的重點內容，以膠原蛋白為主，

2、配合聚氧化乙烯（PEO）或殼聚糖，采用納米靜電紡絲技術，制備獲得膠原蛋白靜電紡絲膜，研究膠原蛋白靜電紡絲膜促進實驗動物大鼠損傷皮膚愈合等功效作用，同時評價膠原蛋白的抑菌和止血作用。為膠原蛋白靜電紡絲膜作為生物敷料提供研究依據。
　　第一章介紹了膠原蛋白靜電紡絲膜研究進展，包括膠原蛋白概況、靜電紡絲技術、膠原蛋白靜電紡絲膜優(yōu)點及研究現(xiàn)狀，臨床應用以及創(chuàng)傷愈合等的內容。
　　第二章研究膠原蛋白的抗菌性能。
　　以羅非魚皮膠

3、原蛋白和牛膠原蛋白(Bovine skin collagen, BSC)為原料，研究BSC、羅非魚皮酶溶性膠原蛋白(Pepsin soluble collagen fromTilapia skin, PSC)、羅非魚皮酸溶性膠原蛋白(Acid soluble collagenfrom Tilapia skin, ASC)的抗菌性能。羅非魚皮經浸提、離心、透析和冷凍干燥等步驟獲得干燥的PSC、ASC。采用含有 BSC、PSC或 ASC的胰

4、蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌，定時測定細菌培養(yǎng)液的吸光度值、菌數(shù)、菌體細胞液電導率和細菌的形態(tài)特征。BSC、PSC、ASC對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌均有不同程度的生長抑制作用，抑制率從22.97％±2.35%到65.21%±6.42%，其中 PSC抑制銅綠假單胞菌作用顯著，抑制率達到65.21%±6.42%；ASC抑制大腸桿菌作用微弱，抑制率只有22.97%±2

5、.35%。血球計數(shù)板法得到的抑菌效果類似吸光度值得到的結果，但是抑制率存在差別。PSC、ASC造成大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌的菌體細胞液電導率從36.42±1.35μs/cm變化到185.80±4.70μs/cm，其中PSC使銅綠假單胞菌的電導率低至36.42±1.35μs/cm，ASC使白色念珠菌的電導率達到185.80±4.70μs/cm。電鏡下觀察到抑菌率高和電導率低的菌株出現(xiàn)菌體變形和細胞壁破裂等現(xiàn)象。與

6、BSC相比，PSC、ASC從細菌抑制率、菌體細胞液電導率和細菌的形態(tài)特征體現(xiàn)出一定的抑菌特性。
　　第三章研究膠原蛋白及其靜電紡絲膜的促愈合性能。
　　以BSC為原料制備膠原蛋白靜電紡絲膜(electrospun bovine collagen nanofibers,EBCN）。膠原蛋白靜電紡絲參數(shù)為：靜電紡絲溶劑為六氟乙丙醇和乙酸的混合溶液，其體積比為50:50，靜電紡絲液濃度為4%，m（膠原）：m（聚氧化乙烯：PEO）為

7、90:10。紡絲參數(shù)電壓為12 kv，推注速度為1 ml/h，接受距離為20 cm。制備兩種EBCN，其中EBCNⅠ為m（膠原）：m（PEO）為90:10， EBCNⅡ為 m（膠原）：m（PEO）：m（殼聚糖）=150:17:2。交聯(lián)條件為紫外照射12 h。通過制作大鼠皮膚全皮層損傷模型進行促進傷口愈合的功效研究，以傷口的愈合率、愈合時間、總蛋白含量、羥脯氨酸含量、病理組織切片和免疫組化分析為指標評價BSC、PSC、ASC和EBCNⅠ、

8、EBCNⅡ的促愈合作用。實驗結果顯示PSC、ASC、EBCNⅠ、EBCNⅡ能夠較快的促進傷口的愈合，縮短愈合時間，且傷口組織中蛋白質和羥脯氨酸的含量明顯高于紗布組，并略高于 BSC和邦迪組。HE染色結果表明，PSC、ASC、EBCNⅠ、EBCNⅡ能夠較好的減少傷口中的炎癥反應，促進成纖維細胞增值，加速膠原纖維形成和膠原沉積，促進肉芽組織生成和再上皮化，從而加速皮膚傷口愈合。免疫組化染色表明 PSC、ASC、EBCNⅠ、EBCNⅡ通過在愈

9、合過程中上調 EGF、FGF、 CD31的水平，從而提高SD大鼠皮膚傷口的愈合速度和愈合質量。
　　第四章研究膠原蛋白及其靜電紡絲膜的止血性能。
　　為了探究 BSC、PSC、ASC、EBCNⅠ、EBCNⅡ的止血性能，以新西蘭大白兔為動物模型，制造耳部靜脈、耳部動脈、肝臟出血創(chuàng)面以及測定體外凝血指數(shù)，探究膠原蛋白靜電紡絲膜的止血效果。ASC、EBCNⅠ、EBCNⅡ組新西蘭兔耳靜脈的止血時間與紗布組比較，差異顯著，EBCNⅠ、

10、EBCNⅡ組能明顯減少出血量。BSC、PSC組與紗布組相比，無顯著性差異。EBCNⅠ、EBCNⅡ組新西蘭兔耳動脈的止血時間與紗布組比較，差異顯著，能減少出血時間和出血量。在新西蘭兔肝臟止血研究中，PSC、EBCNⅠ、EBCNⅡ比紗布組明顯縮短止血時間，ASC、EBCNⅠ、EBCNⅡ能明顯減少出血量，其中EBCNⅠ、EBCNⅡ組效果最好。體外凝血指數(shù)測定結果表明EBCNⅠ、EBCNⅡ組凝血指數(shù)明顯低于紗布組，且具有顯著性差異。EBCNⅠ、