離子注入誘變選育組成型海因酶高效菌.pdf

1、手性氨基酸可作為半合成抗生素、新除草劑、殺蟲劑以及生理活性多肽化學(xué)合成的手性模塊，具有廣泛的應(yīng)用前景。海因酶法是制備手性氨基酸的一種重要的方法。影響海因酶法工業(yè)化的一個重要的因素是海因酶為誘導(dǎo)酶，誘導(dǎo)劑的使用大大增加了生物催化劑成本和生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性。選育組成型的海因酶產(chǎn)生菌對于酶法生產(chǎn)手性氨基酸具有重要的應(yīng)用價值，同時可為海因酶的基因表達(dá)調(diào)控研究提供模式菌。 離子注入誘變技術(shù)是近二十年來發(fā)展起來的新型育種技術(shù)，以其突變率高、突

2、變譜廣等特性在微生物育種中得到廣泛應(yīng)用。 本論文以本實驗室自行篩選的嗜熱海因酶高效菌Bacillus fordii MH602為出發(fā)菌株，采用離子注入誘變選育組成型海因酶高效菌。 離子注入過程中菌體長時間處于干燥、無營養(yǎng)的條件下，本論文首先解決由于干燥及無營養(yǎng)等因素造成菌體死亡率過高從而影響離子注入誘變效果的問題。首次研究了該條件下，多種寡糖對對數(shù)生長期B. Fordii MH602菌體細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果表明海藻糖作保

3、護(hù)劑效果顯著，最佳濃度為2％；同時證明了海藻糖對離子注入效應(yīng)沒有產(chǎn)生負(fù)面影響；根據(jù)離子注入效應(yīng)曲線，選擇了1.8′1016 ions/cm2的10KeV的N＋作為合適誘變劑；豐富了離子注入誘變中的菌體保護(hù)方法。相關(guān)結(jié)論對于采用離子注入誘變技術(shù)對抗干燥性能較差的微生物進(jìn)行菌種選育具有實際指導(dǎo)作用。 首次采用芐基海因和5-氟尿嘧啶作為篩選壓力的兩步篩選法成功地篩選到了5株組成型產(chǎn)酶突變菌（Y2-3、Y2-4、Y2-7、Y7-5、Y7

4、-8）。為了篩選到更高效的組成型海因酶突變株，選用海因酶活力較高的Y2-4進(jìn)行了第二批誘變，加大了篩選壓力，篩選到6株組成型海因酶突變株（YN1-6、YN2-1、YN2-2、YN3-2、YN3-3、YN3-5），其中突變株YN3-2不誘導(dǎo)情況下的海因酶活甚至高于野生菌MH602誘導(dǎo)情況下的海因酶活，且傳代穩(wěn)定性好。 對突變株YN3-2培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，確定了突變株最佳生長溫度為45 ℃，最佳收菌時間為22 h。采用了0.0

5、1％的表面活性劑CTAB增加底物溶解度和細(xì)胞膜通透性。pH對YN3-2海因酶催化轉(zhuǎn)化能力的影響顯著，在pH 9.0的硼酸-硼砂緩沖液中，轉(zhuǎn)化效果最好。初步優(yōu)化后YN3-2不誘導(dǎo)時的海因酶活比MH602誘導(dǎo)時的海因酶活提高了65％，6 h內(nèi)轉(zhuǎn)化10 g/L芐基海因得到9.65 g/L氨甲酰苯丙氨酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到88.15％，該菌株海因酶底物譜廣，既能轉(zhuǎn)化芳香族海因衍生物又能轉(zhuǎn)化脂肪族海因衍生物。 本論文首次將海藻糖用作離子注入誘變