低能N+離子注入誘變的鳳仙花突變體組織培養(yǎng)及其誘變機制分析.pdf

1、鳳仙花(Impatiens balsamine L.)屬鳳仙花科鳳仙花屬,是我國各地廣泛分布的一種多年生常綠草本花卉。常見鳳仙花多為單色,單瓣較多,重瓣花型簡單,且花多為葉腋處著生,大大限制了鳳仙花作為常規(guī)觀賞花卉的充分開發(fā)利用。離子注入作為一種誘變技術(shù)已經(jīng)在多種園藝植物的性狀改良上獲得了成功,通過合適劑量的低能N+離子注入鳳仙花的不同器官,可在誘變的后代中選育出更為符合需要的新品系。但是對于低能離子誘變的鳳仙花的快速組織培養(yǎng)及快繁體系

2、的建立以及突變機制的分析鮮見報道。本項目以低能N+離子束誘導(dǎo)獲得了穩(wěn)定的粉色和紅色鳳仙花突變體為材料,利用組織培養(yǎng)技術(shù)初步建立了鳳仙花突變體體細胞快繁體系。同時采用ISSR、RAPD分子標記技術(shù)對鳳仙花的突變體和對照株的核基因組DNA標記進行擴增并克隆測序,并分析揭示低能N+離子注入引起的鳳仙花基因組變異機制。研究取得的主要結(jié)論如下:
　　 1、初步建立了鳳仙花組織培養(yǎng)技術(shù)體系。確定了下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織形成及繼代的培養(yǎng)基為:MS

3、+6-BA2.5 mg/L+N.AA2.0 mg/L+3％蔗糖+0.5％瓊脂;愈傷組織分化芽的培養(yǎng)基為:1/2 MS+6-BA0.2 mg/L+NAA0.05 mg/L;愈傷組織分化根的培養(yǎng)基為:MS+NAA0.5 mg/L+2.5％蔗糖+0.5％瓊脂;經(jīng)煉苗后移栽,初步獲得了快繁幼苗。
　　 2、建立了鳳仙花的ISSR反應(yīng)體系,并將突變體和對照植株基因組進行了ISSR擴增,將獲得的特異條帶進行了克隆和測序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),從12

4、1條ISSR引物中篩選出了6條可以穩(wěn)定擴增出特異條帶的引物,引物多態(tài)性為4.96％,共擴增出46條特異帶,其中紅色突變體有18條,粉色突變體有28條。在克隆的紅色鳳仙花的ISSR條帶中,共有55個位點發(fā)生了堿基突變;在克隆的粉色鳳仙花的ISSR條帶中,共有71個位點發(fā)生了堿基突變。對特異條帶進行了克隆和測序,序列分析發(fā)現(xiàn):紅色誘變和粉色誘變的堿基變異的類型均包括堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、缺失、插入四種。在紅色突變體中,堿基置換的頻率(70.91

5、％)顯著高于堿基插入和缺失(29.09％)的頻率,而在堿基置換中,顛換的頻率(45.45％)是轉(zhuǎn)換頻率(25.45％)的1.79倍;在粉色突變體中,堿基置換的頻率(76.05％)也顯著高于堿基插入和缺失的頻率(23.95％),而在堿基置換中,轉(zhuǎn)換的頻率(39.44％)接近顛換頻率(36.62％)。通過對其堿基突變次數(shù)的研究,發(fā)現(xiàn)紅色鳳仙花突變體腺嘌呤(A)共發(fā)生22次突變,占總突變數(shù)的40.00％,說明腺嘌呤(A)對低能N+離子具有較高

6、的輻射敏感性;而粉色鳳仙花突變體中胸腺嘧啶(T)共發(fā)生27次突變,占總突變數(shù)的38.03％,較其它三種堿基突變頻率高,說明胸腺嘧啶(T)對低能N+離子具有較高的輻射敏感性。
　　 3、建立了鳳仙花的RAPD反應(yīng)體系,并將突變體和對照植株基因組進行了RAPD擴增,將獲得的特異條帶進行了克隆和測序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),從208條RAPD引物中僅篩選出了6條可擴增出穩(wěn)定特異條帶的引物,其引物多態(tài)性僅為2.89％。共擴增出35條特異帶,其中紅

7、色突變體和粉色突變體中分別為16和19條。在克隆的紅色鳳仙花突變體中,共有60個位點發(fā)生了堿基突變;在克隆的粉色鳳仙花突變體中共有53個位點發(fā)生了堿基突變。對特異條帶進行了克隆和測序,序列分析發(fā)現(xiàn):紅色誘變和粉色誘變的堿基突變類型均包括堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、缺失、插入四種。在紅色突變體中,堿基置換的頻率(73.33％)高于堿基插入和缺失的頻率(26.67％),而在堿基置換中,轉(zhuǎn)換的頻率(40.00％)接近顛換頻率(33.33％);在粉色突變

8、體中,堿基置換的頻率(90.57％)顯著高于堿基插入和缺失的頻率(9.43％),而在堿基置換中,轉(zhuǎn)換的頻率(64.15％)接近顛換頻率(26.42％)的2.43倍。通過對其堿基突變次數(shù)的研究,發(fā)現(xiàn)紅色鳳仙花突變體腺嘌呤(A)共發(fā)生26次突變,占總突變數(shù)的43.33％,說明腺嘌呤(A)對低能N+離子具有較高的輻射敏感性;而粉色鳳仙花突變體的胸腺嘧啶(T)共發(fā)生20次突變,占總突變數(shù)的37.74％,說明胸腺嘧啶(T)對低能N+離子具有較高的

9、輻射敏感性。這與通過ISSR技術(shù)研究的結(jié)果相一致。
　　 4、通過ISSR和RAPD技術(shù)對低能N+離子注入鳳仙花突變體基因組變異的綜合分析發(fā)現(xiàn),低能N+離子注入引起鳳仙花基因組發(fā)生了堿基轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入突變?？倝A基突變率為0.63％,在總數(shù)為239個突變堿基中,單堿基置換頻率為77.40％,顯著高于缺失(13.81％)和插入(8.79％)突變。在堿基置換中,轉(zhuǎn)換(100次)和顛換(85次)出現(xiàn)次數(shù)無顯著差異,A/T顛換頻率