SATB1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與級別相關(guān)性和對生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、背景:
　　SATB1(special AT rich sequence binding protein)是一種組織特異性的核基質(zhì)結(jié)合蛋白(matrix attachment regions binding protein)，在1992年被發(fā)現(xiàn)，目前認(rèn)為其在胸腺和前體B細(xì)胞中顯著表達(dá)，腦組織中亦可見該基因的表達(dá)。SATB1可以與MAR區(qū)域結(jié)合并因此導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)的重塑，進(jìn)而影響到下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表達(dá)，在細(xì)胞周期變化、細(xì)胞凋亡等

2、過程中起作用。
　　根據(jù)近期的研究表明，SATB1基因與多種腫瘤細(xì)胞的侵襲行為和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過對SATB1與乳腺癌的相關(guān)性的研究，首先發(fā)現(xiàn)該基因在乳腺癌的轉(zhuǎn)移方面起到明確的調(diào)控作用。高表達(dá)SATB1的乳腺腫瘤更加具有轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的傾向，因此也導(dǎo)致其預(yù)后情況更加不良。深入的研究表明SATB1高表達(dá)時，可以引起多個傳導(dǎo)通路中的近千個基因表達(dá)的改變，出現(xiàn)或上調(diào)或下調(diào)的明顯的變化?？紤]該基因有可能從結(jié)構(gòu)的層面對整個染色體產(chǎn)生影響，因此，

3、已將該基因在腫瘤中的作用認(rèn)為是一種“組織者”，而不是簡單的單個基因或傳導(dǎo)通路的變化。目前，已有越來越多的資料證實，該基因在胃癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌、卵巢癌以及血液系統(tǒng)腫瘤的疾病中發(fā)揮重要的作用，與腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有密切的關(guān)系，繼而影響到腫瘤患者的預(yù)后。
　　腫瘤侵襲行為和腫瘤細(xì)胞增殖能力的增強(qiáng)可以由多種因素共同作用導(dǎo)致。目前的研究發(fā)現(xiàn)，這種腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，多數(shù)伴有基因水平的改變?；虻谋磉_(dá)調(diào)控是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，其

4、中涉及到的調(diào)控方式也是非常繁雜的。傳統(tǒng)的基因表達(dá)調(diào)控主要山轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)和翻譯水平的調(diào)節(jié)組成。對于大多數(shù)基因來說，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)是其主要調(diào)節(jié)方式，包括各種轉(zhuǎn)錄因子還有輔助因子的參與，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄體系的控制等等。轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)包括RNA的加工，如加帽、加尾、剪接、堿基修飾等，還有mRNA運(yùn)輸、胞漿內(nèi)穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)等。翻譯水平的調(diào)節(jié)主要在起始階段，如起始因子活性的調(diào)節(jié)、mRNA與小亞基結(jié)合的調(diào)節(jié)等。我們推測，SATB1

5、可能在侵襲相關(guān)基因的mRNA表達(dá)方面起到調(diào)節(jié)作用，從而影響下游基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)一步影響到功能。除此之外，染色體結(jié)構(gòu)方面的影響同樣可以導(dǎo)致下游相關(guān)基因的表達(dá)和激活，這種形式的調(diào)控涉及蛋白質(zhì)構(gòu)象等方面的改變，機(jī)制也更為復(fù)雜。目前的觀點(diǎn)是因為SATB1具有能和MAR區(qū)域結(jié)合的傾向，而MAR區(qū)域存在于很多基因的內(nèi)含子區(qū)，SATB1通過和這些非轉(zhuǎn)錄區(qū)序列的結(jié)合可能導(dǎo)致其鄰近基因的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生改變，甚至有可能導(dǎo)致部分基因的啟動子產(chǎn)生變化，從而對

6、其下游基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。
　　膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，同時也是最難治療的腫瘤之一，膠質(zhì)瘤組織的浸潤性增長與復(fù)發(fā)常常使患者在出現(xiàn)癥狀后一二年內(nèi)面臨腫瘤轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致的死亡威脅。長期以來，不少研究者在尋求不同于手術(shù)等傳統(tǒng)途徑的治療方法來攻克這個難題，隨著基因治療開始作為一種新的治療方案開始應(yīng)用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤，該方向的研究也逐漸得到了重視。那么SATB1作為多種腫瘤發(fā)展過程中的基因調(diào)控組織者，是否在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮同樣的作用，我們以此為出

7、發(fā)點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)的研究。
　　材料和方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　U87-MG和U251為人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，均購自上海中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。U87-MG細(xì)胞用含有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、5％CO2、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并使用含0.01MEDTA的0.25％胰酶按要求進(jìn)行傳代和處理。
　　2、半定量RT-PCR

8、>　　將細(xì)胞RNA用Trizol一步法提取出來，并以500ngRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)引物:內(nèi)參β-actin:forward:5'-AAATCGTGCGTGACATTAA-3';reverse:5'-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3'; SATB1 sense5'-CAGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3'，SATB1 antisense5'-GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3擴(kuò)增。引物由Takara

9、 Biotechnology(Dalian，China)合成。PCR儀設(shè)定程序為94.0℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，共進(jìn)行28個循環(huán)，產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖電泳100V30分鐘，紫外線成像，結(jié)果使用Sigma-Gel software進(jìn)行分析。
　　3、Western Blot實驗
　　按前述的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，提取細(xì)胞核蛋白，同時收集、提取總蛋白。Bradford法蛋白定量。10％SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜。5％脫

10、脂奶粉封閉30分鐘。以SATB1為一抗4℃孵育過夜，β-actin為內(nèi)參，PBST沖洗3次，每次5分鐘。HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2小時。PBST沖洗3次，每次5分鐘，ECL發(fā)光。
　　4、免疫熒光分析
　　用0.25％胰酶消化對數(shù)增長期的U87-MG細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，以6×103細(xì)胞/孔加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（內(nèi)放蓋玻片）。24小時后移去培養(yǎng)基，PBS洗1次，饑餓培養(yǎng)過夜，用4％多聚甲醛固定10分鐘。0.25％Trixton

11、X-100的PBS作用10分鐘，血清封閉1小時。加入SATB1抗體（1∶50稀釋），4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記兔抗羊抗體（1∶400稀釋），PBS洗3次，室溫孵育2小時。用熒光顯微鏡LeicaDMIRE2(Leica Microsystems Ltd,Germany)觀測，采集圖像。
　　5、免疫組化染色
　　用石蠟切片機(jī)將石蠟包埋的組織芯片的標(biāo)本切割成厚度為6μm的切片，貼附與防脫載玻片上，65℃烘干30分鐘。將石蠟切片用

12、二甲苯脫蠟，水化，浸入EDTA中，高壓鍋抗原修復(fù)。3％H2O2滅活，兔血清封閉。SATB1抗體1∶50稀釋，4℃孵育過夜。陰性對照組用兔血清替代一抗4℃孵育過夜。HRP標(biāo)記的二抗(KIT-5930，MaxVision，F(xiàn)u Zhou，China)室溫孵育30分鐘。DAB顯色3分鐘。蘇木素復(fù)染，Permount(BIOS，Beijing，China)封片。顯微鏡(Olympus Optical，Japan)觀察，圖像采集。
　　免疫

13、組化染色強(qiáng)度結(jié)果判定:細(xì)胞核中出現(xiàn)棕色顆粒為SATB1陽性表達(dá)細(xì)胞。免疫組化染色強(qiáng)度結(jié)合瘤細(xì)胞陽性染色比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行判定。每例標(biāo)本選擇2個有代表性的高倍視野，數(shù)200個腫瘤細(xì)胞，取平均值.陽性細(xì)胞數(shù)＜5％為陰性（-），5％-25％為弱陽性(+)，25％-50％為中度陽性(++)，＞50％為強(qiáng)陽性(+++)。
　　6、Realtime-PCR定量分析
　　將獲得的總RNA，使用SYBR PrimeScript RT-PCR

14、 Two-Step kit試劑盒按照說明書進(jìn)行realtime RT-PCR檢測。PCR反應(yīng)條件95℃10秒;95℃5秒，60℃20秒，40個循環(huán)。SATB1 Realtime PCR特異性引物: SATB1 sense5'-TGCAAAGGTTGCAGCAACCAAAAGC-3', SATB1 antisense5'-AACATGGATAATGTGGGGCGGCCT-3'。反應(yīng)結(jié)束后分析Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，

15、用Comparative Delta-delta Ct法進(jìn)行相對定量分析。
　　7、組織芯片的制備及結(jié)果分析
　　腫瘤樣本來源于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院診斷為膠質(zhì)瘤并接受治療的患者的術(shù)中樣本。診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)。本研究基于赫爾辛基宣言標(biāo)準(zhǔn)，并被當(dāng)?shù)蒯t(yī)療機(jī)構(gòu)的倫理委員會批準(zhǔn)并同意使用來源于兩所醫(yī)院的組織樣本進(jìn)行科學(xué)研究。實驗組標(biāo)本來源于膠質(zhì)瘤患者術(shù)中瘤組織，對照組非腫瘤樣本來源于癲癇患者行顳葉切除術(shù)的腦組織。組織在切除后快

16、速液氮冷凍，福爾馬林固定，石蠟包埋。根據(jù)文獻(xiàn)報道，用組織芯片機(jī)(Beecher Instruments，Silver Springs，MD，USA)制備組織芯片。組織芯片樣本包括25例散發(fā)星形細(xì)胞瘤（Ⅱ級），27例間變星形細(xì)胞瘤（Ⅲ級）和124例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Ⅳ級）。在每個膠質(zhì)瘤典型病變區(qū)域提取兩個0.6rm孔徑的組織樣本，制作成由352個微點(diǎn)陣構(gòu)成的組織芯片。另外，選取13例癲癇手術(shù)切除的非瘤腦組織制作成組織芯片，作為對照。染色方法同

17、免疫組化操作。
　　8、RNA干擾實驗
　　SATB1 siRNA為Santa(Santa Cruz，CO，USA)合成的SATB1 siRNA。根據(jù)操作手冊，用Santa transfection reagent轉(zhuǎn)染試劑將100nM SATB1 siRNA轉(zhuǎn)染入U87-MG細(xì)胞。control siRNA(Dharmacon)作為陰性對照。SATB1的沉默效率用Western Blot檢測。
　　9、SATB1過表達(dá)

18、脂質(zhì)體的構(gòu)建篩選和轉(zhuǎn)染實驗
　　選擇pEGFP-N1脂質(zhì)體連入SATB1目的基因構(gòu)建SATB1過表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)序列特征，設(shè)計選用XhoⅠ和BamHⅠ對表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳后回收約4.7kb的載體片段?；蛭膸煺{(diào)取目的基因后，連入脂質(zhì)體。應(yīng)用感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，挑取并鑒定陽性克隆后，鑒定測序。脂質(zhì)體構(gòu)建完畢后，應(yīng)用Lipofectamine對U87-MG細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，經(jīng)G418篩選后，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　10、M

19、TT分析。
　　通過MTT法來研究SATB1 siRNA干擾及過表達(dá)SATB1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對U87-MG細(xì)胞增殖的影響。將處理后的細(xì)胞胰酶消化制成懸液，計數(shù)3次，向96孔板每孔加細(xì)胞懸液200μl，約含5000個細(xì)胞，對照組只加相同體積的培養(yǎng)基。分別在0，24，48，72，96小時取出1個96孔板，每孔加20μl5mg/ml的MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時，將培養(yǎng)基吸出，每孔加150μlDMSO，震蕩10分鐘。570nm波長檢測吸光值

20、。
　　11、Transwell侵襲實驗
　　將50mg/L基質(zhì)膠(BD bioscience，San Jose，CA，USA)與無血清培養(yǎng)基以1∶7比例混合，取50μl鋪于Transwell小室底部膜的上室面，待凝固后進(jìn)行實驗。將轉(zhuǎn)染24小時后的U87-MG細(xì)胞胰酶消化制成懸液計數(shù)3次，向Transwell小室上室內(nèi)加細(xì)胞懸液200μl（含1％FBS），約含2000個細(xì)胞。向下室加500μl培養(yǎng)基(含20％FBS)，再向上

21、室及下室同時添加EGF，對照組只加同體積的培養(yǎng)基。24小時后，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞。用甲醇和冰乙酸按1∶3的比例配制成固定液，將細(xì)胞固定30分鐘。風(fēng)干后，用Giemsa工作液染色10分鐘，200倍視野下隨機(jī)選5個視野進(jìn)行計數(shù)。
　　12、統(tǒng)計學(xué)分析
　　不同組間的比較用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)都用SigmaPlot軟件(SigmaSoftware Inc.，San Jose，CA)進(jìn)行統(tǒng)計，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)差

22、異。
　　結(jié)果:
　　1、SATB1在膠質(zhì)瘤組織中基因和蛋白水平均有表達(dá)
　　在半定量的RT-PCR檢測中，我們可以看到SATB1可以被特異性的擴(kuò)增，因此證實在核酸水平，SATB1基因穩(wěn)定的表達(dá)于這種腦組織最常見的惡性腫瘤中。在蛋白水平，我們充分論證了SATB1的表達(dá)與激活。使用western blot方法檢測，可以看到，在約115KD左右存在SATB1基因的穩(wěn)定表達(dá)的蛋白條帶，其強(qiáng)度與β-actin相比有一定差異。用

23、于檢測蛋白的36例不同級別的膠質(zhì)瘤組織和培養(yǎng)的U87-MG、U251和T98G細(xì)胞系除有兩例為陰性外，其余均有SATB1的表達(dá)。為觀察SATB1在組織和細(xì)胞內(nèi)的主要作用位置，我們分別進(jìn)行了免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測。在細(xì)胞的免疫熒光檢查中，可以發(fā)現(xiàn)有比較特意的核濃聚現(xiàn)象，說明該蛋白在核內(nèi)表達(dá)與激活，但同時，在細(xì)胞漿中，亦可見有中等強(qiáng)度的熒光信號表達(dá)，可以推斷，該蛋白在胞漿中存在翻譯、組裝和修飾的過程。
　　2、SATB1在

24、膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)程度與腫瘤級別相關(guān)
　　在定量realtime-PCR實驗中通過與內(nèi)參基因的比對，我們發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤級別和惡性程度的增高，SATB1的表達(dá)量也在隨之發(fā)生增加。這也為我們進(jìn)一步研究提供了新的思路。Western blot結(jié)果則提示蛋白水平，低級別膠質(zhì)瘤與高級別相比，表達(dá)量有明顯差異，利用灰度計算軟件進(jìn)行狄度值比較，可以得到兩組間有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)。而在免疫組化試驗中，應(yīng)用芯片技術(shù)通過對300余例不同

25、級別膠質(zhì)瘤標(biāo)本在同樣條件下的染色觀察，高級別腫瘤的陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)率要明顯高于低級別腫瘤，兩組間有顯著差異(p＜0.01)。
　　3、SATB1 siRNA干擾后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲無影響。
　　利用Santa公司合成的針對SATB1的SMART RNA Pool混合體，進(jìn)行了RNA干擾試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有效的干擾SATB1后，經(jīng)realtime PCR和western blot檢測，SATB1的表達(dá)量明顯下降，但根據(jù)M

26、TT利transwell實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)干擾后的U87-MG細(xì)胞在增殖和細(xì)胞侵襲方面卻并未發(fā)生變化。
　　4、SATB1過表達(dá)轉(zhuǎn)染后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲性增強(qiáng)。
　　在基因水平干擾SATB1的表達(dá)并未對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性和增殖能力產(chǎn)生影響，是否就可認(rèn)為SATB1雖然在不同級別的腫瘤中存在表達(dá)差異，但并未調(diào)控與侵襲和增殖有關(guān)的行為呢？為更進(jìn)一步說明這個問題，我們構(gòu)建了過表達(dá)SATB1基因的脂質(zhì)體進(jìn)行這方面的研究。

27、>　　在成功構(gòu)建表達(dá)SATB1基因的脂質(zhì)體pEGFP-N1-SATB1后，經(jīng)鑒定其序列完全與模板基因序列吻合，測序鑒定無誤后對U87-MG細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。我們使用lipofectamine2000作為轉(zhuǎn)染試劑，在600ng/ul濃度G418篩選6周后，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的過表達(dá)SATB1基因的細(xì)胞系。同樣對SATB過表達(dá)的U87-MG細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)行為方面檢測后，我們卻發(fā)現(xiàn)，MTT實驗的結(jié)果表明:過表達(dá)該基因的細(xì)胞在增殖能力上有一定的增強(qiáng)，