噬菌體與對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病(AHPND)相關(guān)性研究.pdf

1、隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖類動(dòng)物疾病不斷出現(xiàn)，造成了該產(chǎn)業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)蝦急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）是近年來(lái)出現(xiàn)的，一個(gè)困擾對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病，一直到目前為止，我們還沒(méi)有完全明確急性肝胰腺壞死病的致病機(jī)制。該病在2013年由美國(guó)亞利桑那大學(xué)的Tran等人，首次確認(rèn)并分離到了引起AHPND的病原，至此，引起AHPND的病原已經(jīng)被研究者們確認(rèn)。本實(shí)驗(yàn)室自AHPND發(fā)現(xiàn)以來(lái)，就開(kāi)始了對(duì)該病的探究，本文主要是針對(duì)AHPND相關(guān)

2、副溶血弧菌噬菌體展開(kāi)的相關(guān)探究工作。
　　本實(shí)驗(yàn)室從養(yǎng)殖場(chǎng)取的患病凡納濱對(duì)蝦樣品中，分離并鑒定出了5株副溶血弧菌，并通過(guò)使用Flegel和Lo公布的AHPND相關(guān)質(zhì)粒檢測(cè)引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)，明確了這5株副溶血弧菌應(yīng)均為AHPND病原菌。
　　絲裂霉素C可用于誘導(dǎo)溶源噬菌體的分離。本文通過(guò)使用不同濃度絲裂霉素C對(duì)5株AHPND致病性副溶血弧菌進(jìn)行敏感性測(cè)試，經(jīng)過(guò)比較確認(rèn)0.5μg/ml為適宜的使用濃度。通過(guò)濃度為0.5μg/

3、ml的絲裂霉素 C進(jìn)行誘導(dǎo)，從5株 AHPND相關(guān)副溶血弧菌中篩選出有2株副溶血弧菌(編號(hào)分別為20130629002S01和20130726001S01)的生長(zhǎng)曲線表現(xiàn)出溶源性噬菌體進(jìn)入烈解周期的趨勢(shì)，提示可能存在有溶源噬菌體。
　　本文通過(guò)超離心的方法，對(duì)誘導(dǎo)釋放的溶源性噬菌體進(jìn)行收集，并在透射電鏡下觀察，證明上述兩株副溶血弧菌的噬菌體提取物中的確存在噬菌體，但這兩株副溶血弧菌中的噬菌體形態(tài)和大小完全不同，屬于兩種不同的噬菌體

4、，形態(tài)上來(lái)看，phage1類似Wang等的描述，可能屬于肌尾病毒科；而phage2可能屬于蓋病毒科蓋噬菌體屬，具體種屬有待進(jìn)一步驗(yàn)證。該結(jié)果表明所分離的噬菌體可能與副溶血弧菌的AHPND致病性無(wú)關(guān)。
　　用鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體，對(duì)5株含有AHPND相關(guān)質(zhì)粒的副溶血弧菌進(jìn)行致病力測(cè)試，測(cè)試結(jié)果表明，兩株含有溶源性噬菌體的副溶血弧菌具有一定的致病力，但最高致病力的副溶血弧菌并不含有溶源性噬菌體。因此，鹵蟲(chóng)致病力的強(qiáng)弱與AHPND相關(guān)的質(zhì)粒有關(guān)

5、聯(lián)，而與溶源性噬菌體的有無(wú)無(wú)關(guān)，表明噬菌體的存在也不能增加副溶血弧菌的致病力。
　　結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室王海亮從副溶血弧菌毒力株中分離到疑似毒力蛋白VPP19，并根據(jù)編碼基因建立了AHPND檢測(cè)方法(另文發(fā)表)，此外，Sirikharin等從副溶血弧菌毒力株中分離到了可疑的細(xì)菌毒素，并建立了AHPND細(xì)菌的PCR檢測(cè)方法。因此結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的其它研究結(jié)果，筆者認(rèn)為，部分副溶血弧菌毒力株可能攜帶溶源性噬菌體，但是溶源性噬菌體的存在與否與副溶血

6、弧菌的毒力情況沒(méi)有關(guān)系。副溶血弧菌毒力株之間存在著致病能力的差異，但是，目前產(chǎn)生差異的原因并不清楚。
　　在本文中，對(duì)所提取和分離到的兩株溶源噬菌體vp1和vp2的宿主范圍進(jìn)行了測(cè)定，其中vp1可以侵染一株副溶血弧菌，不能侵染本實(shí)驗(yàn)所用的哈維氏弧菌和溶藻弧菌，vp2不能侵染本實(shí)驗(yàn)所用的副溶血弧菌、哈維氏弧菌和溶藻弧菌。
　　本文通過(guò)電轉(zhuǎn)化法，將編碼VPP19蛋白的序列通過(guò)電擊導(dǎo)入到制備的SM10感受態(tài)細(xì)胞中，獲得陽(yáng)性克隆菌株