miR-122與大鼠實驗性肝損傷的相關(guān)性及其功能研究.pdf

1、目的：肝損傷是不同類型肝病的共同特征，也是慢性肝病進(jìn)展至肝纖維化/肝硬化，乃至肝細(xì)胞癌的必要條件。本研究觀察大鼠實驗性肝損傷與miR-122（microRNA 122，miR-122）的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建攜帶miR-122前體（precursor miR-122，pre-miR-122）序列的重組真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞株，評價miR-122對化學(xué)性肝細(xì)胞損傷的影響。 方法：通過經(jīng)皮下注射40％CCl4 2周和6周后分別

2、建立CCl4誘導(dǎo)的SD大鼠急、慢性肝損傷模型。采用TaqMan探針法檢測成熟miR-122在急、慢性肝損傷過程中的表達(dá)水平變化。根據(jù)pre-miR-122序列構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Pre-miR-122。并以pEGFP-N1-Pre-miR-122轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞株，通過熒光定量PCR法測定miR-122成熟體在肝細(xì)胞的表達(dá)水平。用含CCl4的培養(yǎng)基建立L02肝細(xì)胞株的急性損傷模型后，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。通過MTT法測定2h、

3、4h、6h和10h時細(xì)胞的存活率，并觀察培養(yǎng)上清液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aminoleucine transferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性。 結(jié)果：成熟miR-122在大鼠急、慢性肝損傷過程中呈進(jìn)行性下降。與正常對照組相比，急性肝損傷組

4、的miR-122水平下降至正常對照組的28.96％，慢性肝損傷組下降至正常對照組的4.08％。針對pre-miR-122構(gòu)建的pEGFP-N1-Pre-miR-122質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和DNA測序，序列正確。以其轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞株，并采用熒光定量PCR檢測，表明miR-122能夠在肝細(xì)胞株中高效表達(dá)。建立L02肝細(xì)胞急性損傷模型后進(jìn)行pEGFP-N1-Pre-miR-122質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，2d重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組miR-122的表達(dá)升高3.09倍，3d重組質(zhì)

5、粒轉(zhuǎn)染組miR-122的表達(dá)升高6.41倍。2d重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的MDA和SOD指標(biāo)顯著改善，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但ALT、AST二項指標(biāo)無明顯改善；3d重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的ALT、AST、MDA和SOD四項指標(biāo)均得到改善，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論：miR-122在大鼠急、慢性肝損傷過程中出現(xiàn)進(jìn)行性下降。構(gòu)建Pre-miR-122的真核表達(dá)載體能夠在肝細(xì)胞水平實現(xiàn)miR-122的高效率表達(dá)。miR