復(fù)方茵陳脂肝顆粒調(diào)控miR-122及其下游通路治療非酒精性脂肪肝病的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究復(fù)方茵陳脂肝顆粒(ACF)治療非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的作用，并探討其作用機(jī)制，為該藥物的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):將成年雄性SD大鼠72只，隨機(jī)分成對(duì)照組12只、模型組60只，對(duì)照組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，模型組采用高脂飼料喂養(yǎng)方法復(fù)制大鼠NAFLD動(dòng)物模型。8周后將模型組60只大鼠隨機(jī)分為5組，即模型組、復(fù)方蛋氨酸膽堿組、ACF低劑量組、ACF中劑量組、ACF高劑量組，繼續(xù)予以高脂飼料喂養(yǎng)

2、。對(duì)照組、模型組分別按10ml/kg·d-1灌服生理鹽水，復(fù)方蛋氨酸膽堿組按0.24g/kg·d-1灌胃給藥，ACF低、中、高劑量組分別按0.462g/kg·d-1、0.924g/kg·d-1及1.848g/kg·d-1灌胃給藥，給藥期間，每周稱重1次以調(diào)整給藥量，給藥30d后取材;稱量各組大鼠體重、肝組織濕重，計(jì)算各組肝指數(shù);HE染色觀察肝組織病理學(xué)改變;生化比色法檢測(cè)血清中ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量;R

3、eal time-PCR檢測(cè)大鼠肝組織中miR-122的表達(dá);RT-PCR、IHC檢測(cè)大鼠肝組織中脂肪酸合成酶(FASN)的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　體外實(shí)驗(yàn):采用油酸/棕櫚酸(OA/PA)共同刺激人肝癌細(xì)胞株HepG2，制備NAFLD體外細(xì)胞模型并用不同濃度ACF進(jìn)行干預(yù)。油紅O染色觀察胞漿內(nèi)脂質(zhì)沉積情況;酶偶聯(lián)比色法檢測(cè)胞內(nèi)TC、TG的含量;Real time-PCR檢測(cè)miR-122的表達(dá);Real time-PCR、Wes

4、tern Blot檢測(cè)FASN的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):(1)與對(duì)照組相比，模型組大鼠的肝指數(shù)有明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，復(fù)方蛋氨酸膽堿組和ACF各劑量組的肝指數(shù)與模型組相比均有明顯降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　(2)HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組中肝組織以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列且吻合成網(wǎng)，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈成素條狀排列。模型組大鼠的肝組織有明顯的脂肪性炎性改變

5、（以肝細(xì)胞中大量脂肪空泡，伴有炎細(xì)胞浸潤為主），提示造模成功。復(fù)方蛋氨酸膽堿組及ACF各劑量組的脂肪性炎性改變與模型組相比較有明顯減輕和好轉(zhuǎn);
　　(3)生化比色法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組中血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C的含量顯著增加，HDL-C含量明顯下降，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);膽堿組和不同劑量ACF干預(yù)后，血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C的含量較模型組相比明顯降低(P＜0.05)，但

6、HDL-C含量無明顯差異（P＞0.05）;
　　(4)與對(duì)照組相比，模型組大鼠miR-122表達(dá)明顯降低，F(xiàn)ASN的mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);膽堿組和不同劑量ACF干預(yù)后，各組大鼠肝組織miR-122表達(dá)較模型組顯著升高、FASN的mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。
　　體外實(shí)驗(yàn):(1)油紅O染色結(jié)果顯示，對(duì)照組HepG2細(xì)胞核仁清楚，呈藍(lán)色，細(xì)胞漿內(nèi)有少量著色顆粒樣物質(zhì)。模型組中

7、胞核居中，胞漿內(nèi)有大量被染成桔紅色或紅色的顆粒狀脂滴，分布在靠近細(xì)胞膜的區(qū)域，提示造模成功。不同濃度ACF干預(yù)后，胞漿內(nèi)紅色顆粒狀脂滴有不同程度減少;
　　(2)胞內(nèi)TC、TG含量檢測(cè)顯示模型組中TG、TC濃度比對(duì)照組明顯增高（P＜0.05），不同濃度ACF干預(yù)后TG、TC濃度較模型組明顯降低(P＜0.05);
　　(3)Real time-PCR和Western Blot結(jié)果顯示模型組中miR-122的表達(dá)明顯降低，F(xiàn)AS

8、N的mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);ACF干預(yù)后miR-122的表達(dá)明顯增加，而FASN的mRNA和蛋白表達(dá)降低明顯，與模型組相比較均有顯著差異性(P＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)復(fù)方茵陳脂肝顆粒能明顯改善NAFLD模型大鼠的肝臟脂肪變性和抑制HepG2模型細(xì)胞脂滴聚集，提示復(fù)方茵陳脂肝顆粒對(duì)NAFLD具有明顯的療效;
　　(2)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)復(fù)方茵陳脂肝顆粒能上調(diào)miR-122和下