2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、原發(fā)性肝癌是惡性程度最高的腫瘤之一,目前尚無根治方法。自殺基因療法,又名基因介導的酶-前藥療法,能特異性提高藥物在腫瘤中的濃度,并具備獨特的旁觀者效應,是腫瘤基因治療的重要方法之一。本研究將木薯來源的linamarase(lis)引入肝癌基因治療中,利用其水解前體藥物linamarin(lin),并產生毒性代謝產物HCN的特性,從而實現對肝癌細胞的殺傷。通過建立lis穩(wěn)轉肝癌細胞系,發(fā)現其本身對細胞生長,細胞周期等特性并無影響。此外單獨

2、使用前體藥物lin也未發(fā)現細胞毒性,從而提示了該策略的安全性。為提高目的基因的表達及針對肝癌的靶向性,我們以ViraPower?病毒載體系統(tǒng)為基礎,分別構建CMV及AFP啟動子轉錄的lis腺病毒載體。體外實驗表明,含CMV啟動子的腺病毒聯合lin具備針對多種腫瘤細胞的強大抑制效應及旁觀者效應。而含AFP啟動子的病毒僅具備對AFP陽性肝癌細胞的特異性殺傷,從而體現了其針對肝癌的特異性和靶向性。動物實驗提示lis能特異性表達于肝癌組織中,聯

3、合使用lin后能顯著抑制腫瘤生長并延長動物存活時間。結果表明,lis/lin系統(tǒng)是一種潛在的肝癌基因治療策略,值得進一步深入研究。
  目的:
  1.構建穩(wěn)定轉染lis基因的肝癌細胞系,實現lis酶在真核細胞中的活性表達,觀察它對腫瘤細胞的體內、體外生物學特性的影響。初步了解lis基因及l(fā)in對肝癌細胞的作用;
  2.運用ViraPower?腺病毒載體系統(tǒng),構建CMV啟動子轉錄下的lis重組腺病毒載體,觀察該病毒載

4、體的感染效率及目的基因表達情況。應用重組病毒聯合前體藥物lin進行多種腫瘤細胞系的體內、體外治療,探討腺病毒載體介導的lis/lin系統(tǒng)的抑瘤效果及作用機理;
  3.克隆AFP啟動子,檢測其靶向轉錄活性。構建AFP啟動子轉錄的lis重組腺病毒,通過體外實驗及裸鼠荷瘤實驗來檢驗該病毒前藥體系針對AFP陽性肝癌細胞的特異性殺傷,實現lis/lin系統(tǒng)治療原發(fā)性肝癌轉錄水平上的靶向調控。
  方法:
  1.PCR法從木薯

5、cDNA中克隆并擴增liscDNA,將該基因亞克隆至pcDNA3.1+質粒中,構建重組真核表達載體。脂質體轉染及藥物篩選相結合,構建穩(wěn)定轉染lis肝癌細胞系HepG2/lis。觀察穩(wěn)轉細胞形態(tài)學變化,生長曲線,流氏細胞周期,裸鼠體內成瘤曲線等,并進行腫瘤細胞內lis酶活性分析。用不同濃度的lin培養(yǎng)HepG2細胞,觀察lin本身對HepG2細胞生長的影響及細胞毒性;
  2.將liscDNA亞克隆于ViraPower?腺病毒載體系

6、統(tǒng)的入門克隆pENTRTM2B中,利用特異性LR反應將入門克隆中的lis導入腺病毒骨架載體pAd/CMV/V5-DEST中(含CMV啟動子),獲得重組病毒骨架載體pAd/CMV/lis。線性化骨架載體并轉染293A細胞,包裝重組腺病毒Ad-CMV-lis。擴增并純化重組腺病毒,TCID50法測定它的滴度。利用含報告基因的腺病毒Ad-CMV-EGFP感染腫瘤細胞,摸索病毒的最佳感染復數。通過聯合Ad-CMV-lis及前藥lin進行多種腫瘤

7、細胞系的體外及體內抑瘤實驗,觀查該系統(tǒng)的抑瘤活性及旁觀者效應。用DNA片段化檢測、Annexin-V/PI流式細胞分析、瘤組織病理學及TUNEL染色進一步探索lis/lin系統(tǒng)的抑瘤機理。
  3.RT-PCR法從HepG2(AFP+)細胞基因組中克隆并擴增AFP啟動子,亞克隆入pEGFP-1質粒中,利用報告基因EGFP檢測其特異性轉錄活性。用AFP啟動子替換pcDNA3.1+質粒中的CMV啟動子,然后將liscDNA插入該質粒多

8、克隆位點中,實現AFP啟動子與lis的串聯。通過構建病毒入門載體及LR反應,將AFP-lis序列定向克隆于pAd/PL-DEST腺病毒骨架載體中(不含啟動子),獲得骨架載體pAd/AFP/lis。將其轉染293A細胞,包裝重組腺病毒Ad-AFP-lis。重組病毒經擴增、純化后,聯合lin進行體內、體外抑瘤實驗,驗證該體系對AFP陽性腫瘤細胞的特異性及靶向性殺傷。
  結果:
  1.成功構建lis穩(wěn)轉肝癌細胞系HepG2/l

9、is。發(fā)現它與空質粒轉染組及空白對照細胞相比,在細胞形態(tài),生長曲線,細胞周期分布,體內成瘤生長曲線等方面差異不顯著(P>0.05)。HepG2/lis細胞給予lin后,能產生代謝產物HCN,并隨lin濃度的增加而增多,提示lis酶在真核細胞中能以活性方式表達。此外單獨使用lin對細胞生長并無抑制作用。
  2.成功構建重組腺病毒Ad-CMV-lis。聯合應用lin后能在體內、體外有效抑制多種腫瘤細胞的生長,抑瘤作用與lin呈明顯的

10、時間、劑量依賴效應。腫瘤細胞治療后經DNA片段化檢測未發(fā)現典型的凋亡DNAladder,Annexin-V/PI流式細胞分析提示經治療后凋亡及壞死細胞均增高,但以壞死細胞增高為主。瘤組織病理學觀察發(fā)現Ad-CMV-lis/lin治療組中出現大量的壞死區(qū),并發(fā)現較多的TUNEL陽性染色細胞。
  3.克隆并重組了276bp的AFP啟動子。EGFP報告基因分析提示,該啟動子具備AFP陽性肝癌細胞的特異性轉錄活性。成功構建AFP啟動子轉

11、錄下的重組腺病毒Ad-AFP-lis,實現了lis在AFP陽性肝癌細胞系中的高效特異性表達。體外及動物治療實驗均證明,該病毒聯合lin治療,能特異性抑制AFP陽性肝癌細胞系的生長,并延長動物存活時間,而對AFP陰性肝癌細胞系無殺傷效果。
  結論:
  1.植物來源的liscDNA能穩(wěn)定表達于真核細胞中,并能正確包裝出類似大小,具備β-葡萄糖苷酶活性的lis蛋白。liscDNA在細胞中的穩(wěn)定整合對細胞形態(tài)、生長特性、細胞周期

12、、成瘤性等生物學特點并無明顯影響。而前體藥物lin對細胞也具有低毒性,因此lis/lin系統(tǒng)是一種安全的自殺基因治療策略。
  2.通過重組腺病毒載體,發(fā)現腺病毒具有靶細胞感染率及目的基因表達水平高,包裝使用方便,病毒滴度高,不整合到宿主基因組中等優(yōu)點,因此能作為lis/lin自殺基因治療的高效表達載體。
  3.重組腺病毒Ad-CMV-lis在體內、體外均表現出對多種腫瘤細胞系的抑制作用,提示lis/lin自殺基因系統(tǒng)具備

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