EZH2在肺癌中表達(dá)的病理學(xué)意義分析.pdf

1、研究背景與目的:
　　 近年來(lái)，肺癌的發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢(shì)，已成為全球面臨的嚴(yán)峻的健康問(wèn)題。預(yù)計(jì)到2025年，中國(guó)的肺癌患者將達(dá)到100萬(wàn)，居世界首位。進(jìn)一步探索與肺癌發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物具有積極意義。
　　 EZH2(Enhancer ofzeste homolog2)是果蠅zeste基因增強(qiáng)子的人類同源物，屬PcG(Polycomb Group)基因家族的重要成員之一。它是于1996年被發(fā)現(xiàn)

2、的一種新的人類基因，定位于人染色體7q35位置上。PcG和TrxG(Trithorax Group)蛋白是防止細(xì)胞身份發(fā)生改變的細(xì)胞記憶系統(tǒng)的重要成分。PcG蛋白構(gòu)成不同的PRC(Polycomb Repressive Complex)蛋白質(zhì)復(fù)合物，主要包括PRC1和PRC2。EZH2是組成PRC2蛋白復(fù)合物的一個(gè)催化亞基，在其功能中起核心作用。EZH2含有一個(gè)高度保守SET(Su(var)3-9，E(z)and trithorax)結(jié)

3、構(gòu)域，具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTs)活性。PCR2復(fù)合物通過(guò)EZH2基因的SET結(jié)構(gòu)域?qū)诵◇w組蛋白H3的27位賴氨酸(H3K27)進(jìn)行甲基化修飾，然后觸發(fā)PCR1復(fù)合物成分在特定基因位點(diǎn)聚集從而導(dǎo)致下游靶基因沉默，而這些靶基因涉及了多種生物學(xué)基本過(guò)程的調(diào)控，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞老化和細(xì)胞分化等。此外，EZH2與組蛋白脫乙酰化酶(HDACs)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)在結(jié)構(gòu)和功能上存在聯(lián)系，三者共同調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄抑制。近年的

4、研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在多種腫瘤中明顯高表達(dá)，如乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、膀胱癌、胃癌等。目前，有關(guān)EZH2蛋白在肺癌中的表達(dá)尚處于定性層面，且在多種類型肺癌中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?；谏鲜鲅芯楷F(xiàn)狀和背景，本研究采用免疫組化結(jié)合圖像分析技術(shù)，從量化角度探討EZH2蛋白在肺癌組織中的表達(dá)規(guī)律及與增殖、預(yù)后的關(guān)系，并從蛋白和mRNA水平探討EZH2在不同人肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，用免疫組化方法檢測(cè)肺癌性胸水脫落細(xì)胞EZH2的表達(dá)，并利用RNA干擾技術(shù)

5、對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株GLC-82進(jìn)行EZH2基因沉默，探討EZH2對(duì)GLC-82細(xì)胞形態(tài)、增殖及轉(zhuǎn)移的影響。
　　 方法:
　　 一、EZH2在肺癌組織中表達(dá)的定量分析及與增殖、預(yù)后的關(guān)系
　　 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)32例正常成人肺組織、24例肺良性病變組織、113例肺癌組織、57例對(duì)應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中EZH2蛋白的表達(dá);同時(shí)在113例肺癌組織中檢測(cè)增殖相關(guān)抗原Ki67的表達(dá);用計(jì)算機(jī)ImageproPlus6.0

6、(IPP)圖像分析軟件定量測(cè)試蛋白表達(dá)的陽(yáng)性單位（PU值）。
　　 二、EZH2在不同人肺癌細(xì)胞株及肺癌胸水脫落細(xì)胞中的表達(dá)
　　 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)人不同肺癌細(xì)胞株（A549、GLC-82和H358）中EZH2、Ki67和p53蛋白的表達(dá)，IPP圖像分析軟件測(cè)試各蛋白表達(dá)的PU值;Western Blot方法檢測(cè)A549、GLC-82和H358細(xì)胞中EZH2蛋白的表達(dá)，ImageJ圖像分析軟件測(cè)試蛋白表達(dá)的灰度值，以

7、目的/內(nèi)參蛋白灰度比值表示蛋白表達(dá)情況;qRT-PCR方法檢測(cè)A549、GLC-82和H358細(xì)胞中EZH2 mRNA的表達(dá);免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)5例肺癌性胸水和2例結(jié)核性胸水脫落細(xì)胞中EZH2蛋白的表達(dá)情況。
　　 三、RNA干擾沉默EZH2基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞株GLC-82的影響
　　 設(shè)計(jì)合成兩條EZH2干擾序列，利用RNA干擾技術(shù)將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人肺腺癌細(xì)胞株GLC-82以抑制EZH2基因的表達(dá)，通過(guò)qRT-PCR、

8、Western Blot方法檢測(cè)抑制效率，篩選干擾效果較好的EZH2干擾序列來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用IPP圖像分析軟件測(cè)量形態(tài)參數(shù)以檢測(cè)細(xì)胞的形態(tài)變化，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖改變，劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力變化，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（VEGF、MMP2、MMP9和TIMP2）在mRNA水平表達(dá)的變化;Western Blot檢測(cè)增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（E-cadherin、CyclinD1、Tima1、Akt和p-

9、Akt）在蛋白水平的表達(dá)變化;細(xì)胞滴片免疫組化檢測(cè)增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（Ki-67、p53、EGFR和PTEN）在蛋白質(zhì)水平表達(dá)的變化;細(xì)胞石蠟切片免疫組化檢測(cè)增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（Ki-67、p53、Vimentin和MMP2）在蛋白質(zhì)水平表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 一、EZH2在肺癌組織中表達(dá)的定量分析及與增殖、預(yù)后的關(guān)系
　　 1.EZH2在正常成人肺組織、肺良性病變和肺癌組織中的免疫組化定量

10、結(jié)果顯示:
　　 a)肺癌組織中EZH2的PU值顯著大于正常成人肺組織和肺良性病變組織（P=0.000，P=0.000）;正常成人肺組織中EZH2的PU值與肺良性病變組織相似(P=0.716); EZH2的PU值在支氣管擴(kuò)張、肺大泡及肺結(jié)核三種肺良性病變組織間無(wú)顯著差異（P=0.231）;
　　 b)小細(xì)胞癌中EZH2的PU值分別大于鱗癌和腺癌(P=0.003，P=0.018);
　　 c)肺癌原發(fā)灶中EZH2的

11、PU值明顯小于其對(duì)應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶
　　 （P=0.001）;伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中EZH2的PU值大于尚無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌（P=0.031）;
　　 d)高分化肺癌中EZH2的PU值分別小于中-低分化和未分化肺癌（P=0.015，P=0.003）;pTNM分期Ⅰ-Ⅱ期肺癌中EZH2的PU值顯著小于Ⅲ-Ⅳ期肺癌(P=0.000);肺癌組織中EZH2的PU值與患者性別、年齡、吸煙史、大體類型及腫瘤直徑均無(wú)關(guān)（P＞0.05）

12、。
　　 2.Ki67在肺癌組織中的免疫組化定量結(jié)果顯示:肺癌組織中Ki67的PU值與患者性別、年齡、吸煙史、組織學(xué)類型、大體類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度、pTNM分期和腫瘤直徑均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。
　　 3.EZH2和Ki67的表達(dá)的相關(guān)性和一致性分析結(jié)果顯示:
　　 a)定量EZH2和Ki67蛋白的表達(dá)，二者的PU值呈正相關(guān)關(guān)系(P=0.006，r=0.257)。
　　 b)半定量EZH2和Ki

13、67的表達(dá)，二者表達(dá)無(wú)顯著差異(P=0.473)，吻合度具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，Kappa=0.411）。
　　 4.生存分析結(jié)果顯示:
　　 a)EZH2、Ki67的單獨(dú)表達(dá)和二者的聯(lián)合表達(dá)對(duì)患者生存時(shí)間的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;相比無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNMⅠ-Ⅱ期、腫瘤直徑＜3cm的患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNMⅢ-Ⅳ期、腫瘤直徑≥3cm患者生存時(shí)間明顯縮短（P=0.004，P=0.008，P=0.02

14、9）;
　　 b) Cox逐步回歸分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤直徑為影響生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.003，P=0.026）。
　　 二、EZH2在不同人肺癌細(xì)胞株及肺癌胸水脫落細(xì)胞中的表達(dá)
　　 1.免疫組化檢測(cè)不同肺癌細(xì)胞蠟塊EZH2蛋白表達(dá)的定量結(jié)果顯示:
　　 a) A549細(xì)胞中EZH2的PU值高于GLC-82和H358細(xì)胞(P=0.015，P=0.000)，GLC-82細(xì)胞中EZH2的PU值高

15、于H358細(xì)胞(P=0.000)。
　　 b) GLC-82細(xì)胞中Ki67的PU值高于A549和H358細(xì)胞（P=0.000，P=0.000），A549細(xì)胞中EZH2的PU值高于H358細(xì)胞(P=0.000)。
　　 c)A549細(xì)胞中p53的PU值高于GLC-82和H358細(xì)胞（P=0.000，P=0.000），GLC-82細(xì)胞中p53的PU值高于H358細(xì)胞（P=0.000）。
　　 2.Western Bl

16、ot檢測(cè)不同肺癌細(xì)胞株中EZH2蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示:A549細(xì)胞中EZH2/β-actin灰度比值分別高于GLC-82和H358細(xì)胞(P=0.001，P=0.000)，GLC-82細(xì)胞中EZH2/β-actin灰度比值高于H358細(xì)胞（P=0.002）。
　　 3.qRT-PCR檢測(cè)不同肺癌細(xì)胞株中EZH2 mRNA表達(dá)的結(jié)果顯示:GLC-82細(xì)胞中EZH2 mRNA的表達(dá)高于A549和H358細(xì)胞（P=0.000，P=0.00

17、0），A549細(xì)胞中EZH2 mRNA的表達(dá)高于H358細(xì)胞(P=0.000)。
　　 4.免疫組化檢測(cè)胸腔積液脫落細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)結(jié)果顯示:5例肺癌性胸腔積液中均檢測(cè)到了EZH2陽(yáng)性表達(dá)的肺癌脫落細(xì)胞，2例結(jié)核性胸腔積液中均未檢測(cè)到EZH2陽(yáng)性脫落細(xì)胞。
　　 三、RNA干擾沉默EZH2基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞株GLC-82的影響
　　 1.qRT-PCR檢測(cè)EZH2的抑制效率結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照組比較，抑制組

18、1（干擾序列:EZH2-homo-2126）和抑制組2（干擾序列:EZH2-homo-903）中EZH2 mRNA的表達(dá)分別下調(diào)了約89％和75％，抑制組1對(duì)EZH2基因的抑制較好。
　　 2.Western Blot檢測(cè)EZH2的抑制效率結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照組比較，抑制組1和抑制組2中EZH2蛋白的表達(dá)分別下調(diào)了約96.6％和57.8％，同樣證明抑制組1對(duì)EZH2基因的抑制效率較高，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用了EZH2-homo-2126

19、這條干擾序列來(lái)進(jìn)行EZH2基因的沉默。
　　 3.GLC-82細(xì)胞的形態(tài)參數(shù)測(cè)試結(jié)果顯示:除形態(tài)學(xué)參數(shù)細(xì)胞AR在EZH2抑制組中大于陰性對(duì)照組(P=0.013)，其余各形態(tài)學(xué)參數(shù)均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　 4.GLC-82細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照組相比，EZH2抑制組的GLC-82細(xì)胞在24h、48h、72h和96h的OD值均明顯降低(P＜0.001)，細(xì)胞的增殖能力減弱，轉(zhuǎn)染后各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑

20、制率分別為41.2％、55.8％、44.4％和41.8％，以轉(zhuǎn)染后48h最高。
　　 5.GLC-82細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照組相比，EZH2抑制組在劃痕后的第0h、12h、24h、36h、48h的細(xì)胞遷移速度均顯著減慢。
　　 6.GLC-82細(xì)胞的transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照組相比，EZH2抑制組穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P=0.002)。
　　 7.qRT-PCR檢測(cè)（VEGF、

21、MMP2、MMP9和TIMP2）mRNA水平變化結(jié)果顯示:抑制EZH2的表達(dá)后，GLC-82細(xì)胞中VEGF和MMP9的mRNA水平表達(dá)顯著下降（P=0.000，P=0.004），MMP2和TIMP2的mRNA水平表達(dá)無(wú)顯著改變（P=0.090，P=0.116）。
　　 8.Western Blot檢測(cè)（E-cadherin、CyclinD1、Tiam1、Akt和p-Akt）蛋白水平變化結(jié)果顯示:抑制EZH2的表達(dá)后，GLC-82

22、細(xì)胞中E-cadherin/β-actin和Tiam1/β-actin的灰度比值顯著升高（P=0.000，P=0.001），p-Akt/β-actin的灰度比值顯著下降（P=0.001），CyclinD1/β-actin和Akt/β-actin的灰度比值無(wú)明顯變化（P=0.592，P=0.156）。
　　 9.細(xì)胞滴片免疫組化檢測(cè)（Ki-67、p53、EGFR和PTEN）蛋白水平變化結(jié)果顯示:抑制EZH2的表達(dá)后，GLC-82細(xì)

23、胞中Ki67、p53和EGFR的PU值顯著降低(P=0.000，P=0.002，P=0.000)，PTEN的PU值無(wú)明顯變化(P=0.822)。
　　 10.細(xì)胞蠟塊免疫組化檢測(cè)（Ki-67、p53、Vimentin和MMP2）蛋白水平變化結(jié)果顯示:抑制EZH2的表達(dá)后，GLC-82細(xì)胞中Ki67、p53和Vimentin的PU值顯著降低（P=0.000，P=0.000，P=0.000），MMP2的PU值無(wú)明顯變化(P=0.17

24、8)。
　　 結(jié)論:
　　 1.EZH2可能與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　 2.肺癌中EZH2高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。
　　 3.EZH2表達(dá)水平對(duì)肺癌患者生存時(shí)間的影響無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.5例肺癌胸水中均檢測(cè)到EZH2蛋白陽(yáng)性表達(dá)的肺癌脫落細(xì)胞，可為肺癌的細(xì)胞學(xué)診斷初步提供新的思路。
　　 5.EZH2基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞GLC-82形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，使細(xì)胞的增殖、遷移