急性移植排斥反應(yīng)過程中HLA-G表達(dá)動態(tài)變化的實(shí)驗(yàn)及臨床研究.pdf

1、背景： 器官和組織移植是20世紀(jì)的醫(yī)學(xué)壯舉，為挽救人類生命做出了超乎尋常的貢獻(xiàn)。隨著組織配型、器官保存、移植手術(shù)、術(shù)后抗感染等一系列臨床技術(shù)的不斷進(jìn)步，移植器官的存活率以及患者的生活質(zhì)量和生存率都得到了很大的提高，使得器官移植成為治療終末期器官功能衰竭最有效的治療手段。 然而，移植術(shù)后的排斥反應(yīng)，尤其是急性排斥反應(yīng)，仍然是導(dǎo)致移植器官功能喪失、甚至患者死亡最主要的原因。盡管移植物局部組織的病理活檢可以對排斥反應(yīng)做出明確診

2、斷，而且一直被公認(rèn)為是診斷移植排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其具有創(chuàng)傷性、容易誘發(fā)并發(fā)癥等缺點(diǎn)，在臨床上難以成為常規(guī)的檢查手段；臨床常用的生化學(xué)等檢查只有在移植器官組織結(jié)構(gòu)明顯異常，影響到器官功能時才能做出診斷。而目前研究較多的細(xì)胞因子、抗體等檢查，則往往由于其準(zhǔn)確性、敏感性、特異性方面的不足而無法得到廣泛的應(yīng)用。到目前為止，仍沒有一種可以及時、準(zhǔn)確診斷排斥反應(yīng)的公認(rèn)的檢測方法。 在無法準(zhǔn)確了解患者免疫狀態(tài)的情況下，免疫抑制劑是預(yù)防排

3、斥反應(yīng)發(fā)生的最有效的手段，但過量的免疫抑制劑往往導(dǎo)致嚴(yán)重感染和腫瘤等惡性疾病的發(fā)生。 因此如何通過一種無創(chuàng)性的檢測方法準(zhǔn)確地反映患者的免疫狀態(tài)并及時發(fā)現(xiàn)、預(yù)測排斥反應(yīng)的發(fā)生是移植研究領(lǐng)域一個亟待解決的重大課題。只有這樣，才能在預(yù)防排斥反應(yīng)和減少免疫抑制劑用量之間尋找到一個適宜的平衡點(diǎn)，制定個性化的治療方案，達(dá)到最佳的治療效果。 以往相關(guān)研究主要從淋巴細(xì)胞活化的角度加以研究，但從另一方面看，移植術(shù)后穩(wěn)定的患者大多處于免疫抑

4、制或免疫耐受狀態(tài)，而發(fā)生排斥的患者則是打破了業(yè)已建立的免疫抑制狀態(tài)而使得免疫細(xì)胞重新激活并發(fā)揮同種異體殺傷作用。那么能否從免疫耐受的角度著手，借觀察宿主免疫耐受相關(guān)因素的變化來預(yù)測排斥反應(yīng)的發(fā)生呢? 胚胎植入是誘導(dǎo)免疫耐受最成功的典范，從本質(zhì)上看，胚胎植入的過程，其實(shí)就是母體對帶有父方異體抗原成分的胚胎的免疫耐受過程。器官移植和胚胎植入是兩個密切相關(guān)的研究領(lǐng)域，雖然同樣是同種異體之間的免疫應(yīng)答，胚胎植入和器官移植的結(jié)局卻截然相反

5、，這其中涉及很多種蛋白和分子的參與。其中非經(jīng)典主要組織相容性復(fù)合體（MHC），尤其是HLA-G的差異性表達(dá)，引起了越來越多胚胎學(xué)研究和病理妊娠研究領(lǐng)域?qū)＜业闹匾暋?HLA-G是一種非經(jīng)典MHC-Ⅰ類抗原，與經(jīng)典MHC-Ⅰ類抗原的基因高度同源，蛋白結(jié)構(gòu)也很相似。不同的是，HLA-G分子不具有豐富的多態(tài)，也不像經(jīng)典MHC-Ⅰ抗原那樣分布廣泛。生理狀態(tài)下HLA-G僅表達(dá)于胚胎滋養(yǎng)層和一些免疫豁免部位。從功能上看，HLA-G分子可與N

6、K細(xì)胞、T細(xì)胞和APC細(xì)胞等免疫細(xì)胞的抑制性受體結(jié)合，傳遞抑制性信號，從而抑制母體免疫細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)母體對胚胎抗原的免疫耐受。母胎界面HLA-G表達(dá)下降與流產(chǎn)、子癇等病理妊娠的發(fā)生密切相關(guān)。 胚胎學(xué)的研究成果為器官移植免疫的研究提供了新的思路。那么從器官移植的角度來看，移植術(shù)后HLA-G的表達(dá)是否呈現(xiàn)出規(guī)律性的變化?排斥反應(yīng)發(fā)生時，HLA-G的表達(dá)是否會有相應(yīng)的變化?是否有助于臨床上排斥反應(yīng)的診斷呢?免疫抑制劑對機(jī)體HLA-G

7、的表達(dá)有怎樣的影響作用呢?這一系列問題尚未引起人們的重視。如果解決了上述問題，將有助于闡述HLA-G分子在器官移植中的作用機(jī)制，為臨床排斥反應(yīng)的診斷提供新的思路。 臨床上，移植受者術(shù)后常規(guī)接受免疫抑制劑治療以誘導(dǎo)耐受，因此難以區(qū)分移植排斥反應(yīng)和免疫抑制劑對HLA-G的不同作用，因而有必要利用動物模型來系統(tǒng)研究移植排斥反應(yīng)發(fā)生過程中HLA-G分子表達(dá)的變化規(guī)律，并獨(dú)立探討免疫抑制劑對其的影響作用。 小鼠的Qa-2分子與人類

8、HLA-G分子在結(jié)構(gòu)和功能上均具有高度的同源性，而且純系小鼠之間的皮膚移植模型是最經(jīng)典的排斥反應(yīng)動物模型，手術(shù)簡便，易于觀察。因此小鼠皮膚移植模型成為本次研究的理想動物模型。 為了系統(tǒng)的研究移植排斥反應(yīng)發(fā)生過程中HLA-G分子表達(dá)的變化規(guī)律以及免疫抑制劑的影響作用，我們首先以近交系小鼠皮膚移植模型研究了移植術(shù)后不同時間移植物、浸潤淋巴細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞（PBLs）以及血漿中Qa-2的表達(dá)，分析了其與移植排斥反應(yīng)分級之間的相關(guān)性

9、和不同劑量免疫抑制劑的影響作用。并在動物研究的基礎(chǔ)上，動態(tài)監(jiān)測了臨床腎移植術(shù)后穩(wěn)定患者和排斥患者術(shù)后不同時間外周血單個核細(xì)胞以及血漿HLA-G的不同表達(dá)，探討了HLA-G對移植物排斥反應(yīng)的診斷價值，并分析了其與患者免疫耐受狀態(tài)之間的關(guān)系，以期為臨床制定個性化免疫抑制方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的： 1、利用成功建立的小鼠皮膚移植模型，動態(tài)監(jiān)測用藥和不用藥狀態(tài)下移植受者術(shù)后不同時間小鼠Qa-2分子在移植物、浸潤淋巴細(xì)胞、外周血淋

10、巴細(xì)胞、血漿中的表達(dá)變化，揭示移植受者Qa-2分子在移植排斥反應(yīng)發(fā)生過程中的變化規(guī)律，探討其與同種異體急性移植排斥反應(yīng)發(fā)生進(jìn)程之間的對應(yīng)關(guān)系。 2、通過檢測不同種類、不同劑量免疫抑制劑單一或聯(lián)合作用下小鼠Qa-2表達(dá)的變化，分析免疫抑制劑種類和劑量對Qa-2表達(dá)的不同作用，探討Qa-2表達(dá)對機(jī)體免疫抑制狀態(tài)的監(jiān)測價值，以期為指導(dǎo)臨床制定個性化治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 3、動態(tài)監(jiān)測腎移植患者術(shù)前和術(shù)后不同時間外周血單個核細(xì)胞

11、HLA-G轉(zhuǎn)錄和蛋白水平以及血漿可溶性HLA-G表達(dá)的變化規(guī)律，對比穩(wěn)定組和排斥組的差異，探討HLA-G對于移植排斥反應(yīng)的診斷價值、最佳檢測方法以及對患者免疫狀態(tài)的監(jiān)測作用。 方法： 1．建立小鼠皮膚移植動物模型：為研究不同鼠系之間的差別，分別以SPF級近交系C57BL/6（簡稱C57）和BALB/C（簡稱BA）兩種鼠系作為研究對象，分別隨機(jī)分為正常對照組和手術(shù)組，其中手術(shù)組又分為自身移植組、同系移植組和異系移植組。為了

12、觀察免疫抑制劑的影響，同系和異系移植組又分別分為不用藥組和用藥組。用藥組模擬臨床環(huán)孢素A（CsA）、皮質(zhì)激素（Horm）及霉酚酸酯（MMF）中等劑量三聯(lián)用藥。手術(shù)組采用經(jīng)典的小鼠背一背皮膚移植手術(shù)方法，建立動物模型，術(shù)后每天觀察皮膚移植物大體改變，記錄肉眼排斥時間。每天取移植皮片進(jìn)行HE染色，根據(jù)移植物病理組織學(xué)改變將其分為排斥反應(yīng)Ⅰ-Ⅳ級，記錄移植物病理排斥進(jìn)展情況。觀察用藥和不用藥對移植物存活時間和病理組織學(xué)改變的影響 2．

13、動態(tài)檢測移植術(shù)后Qa-2的表達(dá)：利用成功建立的小鼠皮膚移植模型，術(shù)后每天每組處死5只小鼠，采集移植皮片、外周血淋巴細(xì)胞和血漿，采用免疫組化、Real-Time熒光定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)和ELISA等方法動態(tài)監(jiān)測不同組別小鼠移植受者術(shù)后不同時間點(diǎn)小鼠Qa-2分子在移植物、浸潤淋巴細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、血漿中的表達(dá)變化，分析上述指標(biāo)與排斥反應(yīng)發(fā)生和免疫抑制劑應(yīng)用之間的關(guān)系。 3．免疫抑制劑對Qa-2表達(dá)的影響：將SPF級C57BL/

14、6小鼠隨機(jī)分為對照組、環(huán)孢素組、激素組、霉酚酸酯組和聯(lián)合用藥組，其中三種單一用藥組又分為低、中低、中等、中高、高共5個劑量組，收集外周血淋巴細(xì)胞、血漿以及移植物，采用Real-Time熒光定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA及免疫組化等方法檢測不同種類、不同劑量免疫抑制劑單一作用或聯(lián)合作用下小鼠Qa-2表達(dá)的變化，分析了免疫抑制劑種類和劑量對Qa-2表達(dá)的不同作用，探討了Qa-2表達(dá)對機(jī)體免疫抑制狀態(tài)的監(jiān)測價值，以期為指導(dǎo)臨床制定個性化治

15、療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 4．腎移植患者HLA-G的動態(tài)監(jiān)測：連續(xù)收集57例腎移植患者（其中術(shù)后32例腎功能穩(wěn)定、25例發(fā)生急性排斥反應(yīng)）術(shù)前和術(shù)后不同時間（術(shù)后3天、7天、2周、3周、1月、2月、3月以上）外周血標(biāo)本。懷疑排斥的患者及時進(jìn)行腎活檢明確診斷，并于沖擊治療前、排斥反應(yīng)發(fā)生后3天、7天、2周、3周以上分別收集標(biāo)本。采用Real-Time熒光定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)和ELISA等方法動態(tài)檢測移植受者外周血淋巴細(xì)胞HLA-G轉(zhuǎn)

16、錄和蛋白水平以及血漿可溶性HLA-G表達(dá)的變化規(guī)律，對比分析穩(wěn)定組和排斥組的差異，探討HLA-G對于移植排斥反應(yīng)的診斷價值、最佳檢測方法。 結(jié)論： 1、通過動態(tài)監(jiān)測移植術(shù)后不同時間小鼠Qa-2的表達(dá)變化規(guī)律，首次發(fā)現(xiàn)：移植術(shù)后早期，尤其是在用藥狀態(tài)下，移植物浸潤淋巴細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞Qa-2表達(dá)水平明顯下調(diào)，發(fā)生于淋巴細(xì)胞活化的階段。這一階段尚未造成嚴(yán)重的移植物損傷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于肉眼排斥的發(fā)生。 2、免疫抑制劑可明

17、顯提高移植物、浸潤淋巴細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞HLA-G的表達(dá)，同時延長移植物存活時間，但過高劑量作用反而有所下降。免疫抑制劑中等劑量聯(lián)合應(yīng)用不但可以達(dá)到最大限度上調(diào)HLA-G表達(dá)的作用，而且對動物的毒性較小，是最佳選擇。 3、臨床檢測結(jié)果顯示：腎移植術(shù)后外周血HLA-G的表達(dá)，尤其是CD4+T細(xì)胞HLA-G的動態(tài)改變，與免疫抑制劑用藥時間和劑量密切相關(guān)，并在排斥反應(yīng)發(fā)生時明顯下調(diào)，有可能成為一種反映移植患者免疫耐受狀態(tài)和診斷排斥反