泛素羧基末端水解酶-1及其I93M突變在帕金森病發(fā)病機制中的作用.pdf

1、帕金森病(PD)是一種常見的、危害嚴重的中老年神經(jīng)變性疾病,其主要病理特征是黑質多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡和殘存神經(jīng)元內(nèi)路易小體(Lewy body)形成,臨床上以肌強直、震顫和運動減少等為主要癥狀。PD病因及發(fā)病機制至今不明。一系列的研究結果表明泛素蛋白酶體(Ubiquitin Preteasome System,UPS)降解途徑的異常是導致PD發(fā)病的重要機制之一。而泛素羧基末端水解酶-1(UCH-L1)是UPS降解途徑中的一個重要的功

2、能酶。研究報道,在PD患者甚至阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)患者大腦內(nèi)都發(fā)現(xiàn)有UCH-L1的下調(diào)和廣泛的氧化修飾,1998年Leroy等報道UCH-L1的193M突變可導致常染色體顯性遺傳性PD。因而對UCH-L1及其193M突變在PD的發(fā)病機制中的研究不僅對探討遺傳性PD而且對散發(fā)性PD的致病機制都具有重要意義。
　　 第一部分:抑制UCH-L1去泛素化酶功能對神經(jīng)母細胞瘤細胞SK-N-SH的毒性

3、作用及機制的探討
　　 193M突變?nèi)シ核鼗傅幕钚耘c野生型相比下降了約50％左右,故我們推測UCH-L1去泛素化酶功能受損可能會影響細胞的去泛素化過程而導致細胞毒性作用。
　　 1.UCH-L1抑制劑LDN-57444作用于SK-N-SH細胞系抑制UCH-L1去泛素化酶活性；MTT檢測細胞活力、Hoechst染色檢測細胞核、流式細胞儀(Annexin V-PI)檢測凋亡細胞,結果顯示該抑制劑對細胞的毒性作用呈劑量依賴性

4、,顯微鏡下觀察細胞形態(tài)正常的SK-N-SH細胞貼壁能力強,細胞體積較大,神經(jīng)突起較明顯,加抑制劑24 h后細胞體積變小,突起減少變短,細胞貼壁能力減弱,隨著濃度增加細胞明顯變小變圓,突起幾乎消失,熒光顯微鏡下可見有明顯的核碎裂及凋亡小體。
　　 2.Western Blot檢測多聚泛素化蛋白、熒光定量檢測LIPS功能:經(jīng)UCH-L1抑制劑處理后,多聚泛素化蛋白含量明顯增加,引起UPS功能受損。
　　 3.Western

5、Blot檢測內(nèi)質網(wǎng)應激相關蛋白Bip/Grp78、XBP-1、CHOP/Gadd153的表達,三者在UCH-L1抑制劑作用后表達均升高,提示內(nèi)質網(wǎng)應激參與了UCH-L1抑制劑誘導的細胞凋亡。
　　 4.α-synuclein是否通過UPS途徑降解還存在爭議。UCH-L1抑制劑作用于SK-N-SH細胞并沒有影響a-synuclein的水平,提示α-synuclein通過LIPS途徑降解的觀點還缺乏充足的證據(jù)。
　　 結論及

6、意義:UCH-L1的去泛素化酶功能對神經(jīng)元的存活和正常功能的維持具有重要作用,抑制其去泛素化酶功能,影響了UPS的功能,進而導致多聚泛素化蛋白增加。積聚的多聚泛素化蛋白首先引發(fā)未折疊蛋白反應繼而進展為內(nèi)質網(wǎng)超載反應,最終導致細胞凋亡。UCH-L1抑制劑雖然影響了UPS的功能,導致多聚泛素化蛋白增加,但沒有影響到α-synuclein的水平,提示α-synuclein通過YPS途徑降解的觀點還缺乏充足的依據(jù)。
　　 第二部分:UC

7、H-L41 I93M突變在PD致病機制中的作用
　　 1.在SH-SY5Y細胞系中過表達UCH-L1野生型及193M突變,用共聚焦顯微鏡觀察兩者在細胞內(nèi)的表達、分布情況,結果顯示兩者在轉染后的SH-SY5Y細胞內(nèi)均有表達且表達量豐富。UCH-L1野生型呈均勻一致分布,而193M突變分布不均勻,形成聚集體。
　　 2.免疫熒光顯示聚集體內(nèi)除了有UCH-L1(I93M)外,還有a-synuclein成分和骨架蛋白α-tubu

8、lin共存,這與路易小體性質相似,且過表達I93M突變體對細胞有毒性作用,提示I93M突變形成的聚集體參與了導致PD機制。
　　 3.用Western Blot及免疫共沉淀方法研究I93M突變形成聚集體的因為。MG132能夠阻止UCH-L1的降解,提示UCH-L1是通過UPS途徑降解的,而過表達后隨著時間的推移細胞內(nèi)會有UCH-L1(I3M)的堆積,而UCH-L1野生型則沒有,表明I93M突變后影響了其降解。免疫共沉淀顯示I93

9、M在降解途徑中的泛素化進程受到影響。
　　 結論及意義:UCH-L1 I93M突變過表達對細胞是有毒性作用的。產(chǎn)生毒性作用的可能因為在于I93M突變后的UCH-L1的泛素化進程受到影響,不能通過UPS途徑正常降解導致其堆積。
　　 第三部分:UCH-L1 I93M突變對微管系統(tǒng)影響的初步研究
　　 1.與野生型UCH-L1相比,過表達UCH-L1 I93M突變后,破壞了細胞內(nèi)微管系統(tǒng)的正常的網(wǎng)絡結構。微管蛋白的染

10、色顯示正常的細胞具有復雜清晰的網(wǎng)絡骨架,而I93M過表達的細胞內(nèi)網(wǎng)絡骨架紊亂。
　　 2.微管系統(tǒng)是維持神經(jīng)元突起的必需的結構成分,因而微管系統(tǒng)受到干擾后會導致神經(jīng)突起的退行性病變。我們的實驗結果發(fā)現(xiàn),正常細胞具有長的光滑的突起,而過表達I93M突變尤其形成大量聚集體的細胞內(nèi)的微管系統(tǒng)網(wǎng)絡結構破壞,使得正常的神經(jīng)突觸的形態(tài)無法維持,突起末端變鈍或者呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)。
　　 3.過表達I93M突變形成聚集體和微管系統(tǒng)結構的破

11、壞,加重了內(nèi)質網(wǎng)的負擔,有可能觸發(fā)錯誤折疊蛋白反應/內(nèi)質網(wǎng)應激。我們進一步檢測錯誤折疊蛋白反應觸發(fā)后的標志性蛋白Bip/Grp78,過表達193M突變的細胞內(nèi)Bip/Grp78表達量明顯升高,提示錯誤折疊蛋白反應觸發(fā)。
　　 結論及意義:UCH-L1 I93M突變過表達在細胞內(nèi)形成聚集體并對細胞產(chǎn)生毒性作用,但是聚集體如何影響細胞功能的內(nèi)在機制還不明確。本研究在過表達UCH-L1I93M突變的細胞內(nèi)檢測到微管系統(tǒng)的結構紊亂,以及