豬瘟病毒E0蛋白在酵母系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)與鑒定.pdf

1、豬瘟（Classical Swine Fever，CSF）是一種高度接觸性傳染病，它由豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）引起，具備很高的致死率。豬瘟病毒屬黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，自然感染后，機(jī)體可產(chǎn)生針對(duì)E2、E0和NS3蛋白的抗體。其中，E0是唯一可分泌到豬瘟病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的糖蛋白，另外，從分子學(xué)角度講，編碼E0的氨基酸序列要更為保守。因

2、此，在豬瘟的防治工程中，E0是主要的靶蛋白之一。目前對(duì)豬瘟病毒幾個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白E0，E2和NS3研究較多，市面上的診斷試劑盒也多以E2蛋白為抗原。但是，E0蛋白的功能也同樣重要，它不但可以用來(lái)區(qū)別豬瘟病毒疫苗株和野毒株，而且能夠用來(lái)判斷機(jī)體是否曾經(jīng)感染過(guò)豬瘟病毒?，F(xiàn)階段比較成熟的表達(dá)E0蛋白的方法主要是原核表達(dá)和利用昆蟲細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，這幾種方法不但使得蛋白的產(chǎn)量受到限制，而且所表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性也較低。因此急需一種既能保障重組蛋白產(chǎn)

3、量又能保障其生物活性的表達(dá)E0蛋白的方法，從而為進(jìn)一步研究E0蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　本論文的主要內(nèi)容包括：
　　一：豬瘟病毒E0蛋白在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)與鑒定
　　巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為一種新型的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，既具備了原核表達(dá)系統(tǒng)所具備的操作簡(jiǎn)便、易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)快等優(yōu)點(diǎn)，還具備了原核表達(dá)系統(tǒng)所不具備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠?qū)ν庠吹鞍走M(jìn)行糖基化、磷酸化、折疊、加工

4、和脂類酰化。此外，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)還具備其他表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，例如：含有目前啟動(dòng)能力最強(qiáng)的AOX啟動(dòng)子；糖基化程度低；表達(dá)過(guò)程中所分泌的自身蛋白極少，大大降低了蛋白純化的難度；既可以進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)，也可以利用其特有的α-factor信號(hào)肽序列將所需蛋白分泌至培養(yǎng)基中；另外，在大規(guī)模培養(yǎng)方面，酵母具備很高的優(yōu)越性，適用于高密度發(fā)酵生產(chǎn)且生產(chǎn)過(guò)程成本低廉，外源蛋白的表達(dá)產(chǎn)量也很高。這些特點(diǎn)都使得該系統(tǒng)成為了目前為止應(yīng)用最廣、研究最多的外

5、源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。
　　本研究利用基因工程手段，成功構(gòu)建能夠在畢赤酵母GS115菌株中表達(dá)E0蛋白的重組質(zhì)粒pPIC9K-E0，通過(guò)電轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)化到GS115中，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度以及甲醇的誘導(dǎo)濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了28℃誘導(dǎo)溫度下甲醇終濃度為0.5％誘導(dǎo)120h可以使E0蛋白的產(chǎn)量達(dá)到最高。使用豬瘟病毒陽(yáng)性血清對(duì)粗提后的E0蛋白進(jìn)行Western blot鑒定和間接ELISA鑒定，鑒定結(jié)果表明，利用酵母菌株表達(dá)的重組E

6、0蛋白具備良好的反應(yīng)原性，可以作為包被原對(duì)豬瘟病毒的E0抗體進(jìn)行檢測(cè)。
　　二：豬瘟病毒E0蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定
　　長(zhǎng)期以來(lái)，采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)表達(dá)外源基因已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于各種生物制品的研發(fā)過(guò)程，由于哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)能夠促進(jìn)蛋白的正確折疊和糖基化，因此，相對(duì)于其他兩種常見的表達(dá)系統(tǒng)——大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)，哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的蛋白與天然蛋白具有相似的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能。常用的表達(dá)外源蛋白的哺乳

7、動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)有中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）、COS細(xì)胞、小倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK細(xì)胞）、小鼠骨髓瘤 SP2/0細(xì)胞以及小鼠NSO胸腺瘤細(xì)胞等。在CSFV的培養(yǎng)過(guò)程中，利用同源性的豬腎、豬肺、豬脾或者骨髓等細(xì)胞的培養(yǎng)物非常有利于病毒的增殖，其中，較為常用的細(xì)胞系有SK6、PK-15以及CPK細(xì)胞系。
　　本研究利用基因工程手段，成功構(gòu)建能夠在豬源性PK-15細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白的重組質(zhì)粒PEGFP-E0，并通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)染的方法將其插入