哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)PRRS病毒GP5與GFP融合蛋白及其應(yīng)用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病。該病主要引起妊娠母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各年齡段豬的呼吸道癥狀和高死亡率。PRRSV進(jìn)入Marc-145細(xì)胞的過程是依賴受體進(jìn)行的，目前已鑒定出

2、在細(xì)胞上存在PRRSV的4個(gè)受體：硫酸乙酰肝素(heparinsulfate.HS)、唾液酸粘附素(sialoadhesin.Sn)、CD163分子和波形蛋白(Vimtin)。HS，Sn和CD163三者之間的關(guān)系大體為：HS主要作用是吸附PRRSV到PAM細(xì)胞上，Sn介導(dǎo)PRRSV的內(nèi)吞。CD163和波形蛋白可能起協(xié)助Sn內(nèi)吞、PRRSV脫衣殼和將病毒基因組RNA釋放到細(xì)胞漿的作用。
　　 GP5是PRRSV的一個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白，

3、在PRRSV感染和免疫過程中發(fā)揮重要的作用，因此，研究GP5的受體在各種細(xì)胞表面的分布對(duì)于控制PRRS的傳播與發(fā)病有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果；融合表達(dá)GFP和GP5蛋白，將檢測(cè)基因和報(bào)告基因融合一體，這樣就可以減少非特異性的吸附的問題，提高了檢測(cè)方法的特異性。此外，采用哺乳動(dòng)物真核表達(dá)方式，可以保留蛋白的天然結(jié)構(gòu)和蛋白的生物活性。
　　 為了進(jìn)一步研究和探尋PRRSV受體在細(xì)胞表面的分布，采用反

4、轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR的方法從接種了PRRSV的Marc-145細(xì)胞中擴(kuò)增PRRSV的GP5基因，克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N1中。以pEGFP-N1-GP5為模板擴(kuò)增GP5和GFP融合基因，再克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-HisA中。將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-N1-GP5+GFP轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞后，48h后可以直接通過倒置熒光顯微鏡檢測(cè)GP5和GFP融合蛋白的表達(dá)。成功檢測(cè)到融合蛋白的表達(dá)后，

5、采用鎳柱進(jìn)行融合蛋白純化，然后經(jīng)過免疫印跡(Western-Blot)檢測(cè)收集到的純化蛋白。
　　 我們制備了豬肺巨噬細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞，羊肺巨噬細(xì)胞、PK-15、Vero、MDBK，MCF-7及HEK-293T細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，將純化蛋白與上述細(xì)胞在4℃孵育1h后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)陽性細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在豬肺巨噬細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞表面有PRRSVGP5受體的存在，而羊肺巨噬細(xì)胞、PK-15、Vero、MDBK、