成牙本質(zhì)細(xì)胞極性相關(guān)蛋白cdc42和E-cadherin的表達(dá)及功能.pdf

1、成牙本質(zhì)細(xì)胞是位于牙髓組織最外層的高柱狀細(xì)胞,頂端能夠分泌牙本質(zhì)基質(zhì),底端位于牙髓組織內(nèi),是一種典型的極性化細(xì)胞。在成牙本質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程中,經(jīng)歷了從無(wú)極性化細(xì)胞分化發(fā)育成為極性化細(xì)胞的過(guò)程。該過(guò)程的進(jìn)行同時(shí)也伴隨著成牙本質(zhì)細(xì)胞的成熟與牙本質(zhì)基質(zhì)的分泌。在細(xì)胞頂?shù)讟O性建立過(guò)程中,細(xì)胞連接的形成和極性蛋白復(fù)合物的定位是兩個(gè)必要的細(xì)胞生物學(xué)行為。細(xì)胞連接作為相鄰細(xì)胞間的錨定結(jié)構(gòu),起到阻隔外來(lái)物質(zhì)通透細(xì)胞層的作用,同時(shí)作為細(xì)胞膜分隔條帶,將細(xì)

2、胞膜區(qū)域分為頂端和底端。細(xì)胞連接的建立也為細(xì)胞極性復(fù)合物在細(xì)胞膜上的定位提供了錨定結(jié)構(gòu),是細(xì)胞極性形成的前提。細(xì)胞極性復(fù)合物的發(fā)生及其在細(xì)胞膜特定區(qū)域的定位則是細(xì)胞極性形成的分子基礎(chǔ)。極性分子在細(xì)胞膜的定位決定了細(xì)胞膜相應(yīng)區(qū)域的功能。同時(shí),細(xì)胞連接的建立和極性分子的定位也可以影響細(xì)胞器在胞漿內(nèi)的分布。發(fā)育成熟的成牙本質(zhì)細(xì)胞,其細(xì)胞核位于細(xì)胞的底端,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器則朝向細(xì)胞的分泌端,即細(xì)胞頂端。這種細(xì)胞形態(tài)的形成正是其細(xì)胞極性化

3、分泌功能的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。本課題采用多種分子生物學(xué)方法證實(shí)了與成牙本質(zhì)細(xì)胞極性建立密切相關(guān)的部分蛋白的表達(dá),并對(duì)其功能進(jìn)行了初步探討,以期為相關(guān)研究提供一定的基礎(chǔ)。
　　1.成牙本質(zhì)細(xì)胞部分極性蛋白的表達(dá)
　　提取小鼠牙髓組織和OLCs細(xì)胞的總RNA和總蛋白后,用PCR檢測(cè)cdc42、ZO-1、occludin、claudin-1、E-cadherinmRNA的表達(dá),用westernblot檢測(cè)cdc42蛋白的表達(dá)。OLCs細(xì)胞

4、經(jīng)固定、脫水、通透后,用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)cdc42在OLCs中的表達(dá)定位。出生后2周小鼠及出生前14天、16天、18天胚胎小鼠經(jīng)固定、脫水、浸蠟、包埋、切片后,用組織免疫熒光檢測(cè)cdc42在牙胚發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)。結(jié)果顯示,cdc42、ZO-1、occludin、claudin-1、E-cadherinmRNA及cdc42蛋白在牙髓組織和OLCs中皆有表達(dá)。在OLCs細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中,cdc42皆有表達(dá)并且在細(xì)胞核周圍表達(dá)量明顯高于其他部

5、位。在牙胚發(fā)育過(guò)程中,cdc42參與了成牙本質(zhì)細(xì)胞極性化的發(fā)生過(guò)程。
　　2.成牙本質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞連接的體外建立及其與LPS的關(guān)系
　　OLCs接種于含有α-MEM培養(yǎng)液的transwell小室中培養(yǎng)兩周后,通過(guò)掃描電鏡觀察細(xì)胞排列狀態(tài),通過(guò)透射電鏡觀察細(xì)胞間連接的建立。OLCs接種于6孔板中,各組培養(yǎng)液中加入不同濃度LPS(10ng/ml、100ng/ml、和1000ng/ml),以條件培養(yǎng)液(10ng/mlLPS)中同時(shí)加入

6、NF-κB抑制劑PDTC和LPS組作為對(duì)照;分別培養(yǎng)0.5h、1h、2h、6h,各時(shí)間點(diǎn)采用Westernblot觀察細(xì)胞連接蛋白E-cadherin在蛋白水平的變化;以實(shí)時(shí)定量PCR觀察細(xì)胞連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和E-cadherin在mRNA水平的改變。結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)立體培養(yǎng)的OLCs細(xì)胞間形成了明顯的細(xì)胞連接。經(jīng)過(guò)LPS處理后,ZO-1、occludin、claudin-1和E-cadherin的m

7、RNA表達(dá)水平明顯降低,且在一定的作用時(shí)間范圍內(nèi)呈明顯的時(shí)間依賴性,但與濃度(10-1000ng/ml)無(wú)明顯依賴性。同時(shí),E-cadherin在蛋白水平隨著LPS作用時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)水平逐漸降低,而NF-κB抑制劑PDTC時(shí)能夠抑制這種效應(yīng)。
　　3.cdc42與牙源性細(xì)胞礦化的關(guān)系
　　OLCs細(xì)胞接種培養(yǎng)至融合80％后,實(shí)驗(yàn)組分別更換為礦化誘導(dǎo)液、含10ng/mlLPS的α-MEM培養(yǎng)液和含10ng/mlLPS礦化誘導(dǎo)

8、液經(jīng)一定時(shí)間培養(yǎng)后,通過(guò)westernblot測(cè)定其中cdc42含量的變化;礦化誘導(dǎo)液組和含ML141的礦化誘導(dǎo)液組培養(yǎng)一定時(shí)間后,通過(guò)茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況并進(jìn)行定量分析。HDPSCs在含不同濃度LPS的礦化誘導(dǎo)液和含不同濃度ML141的礦化誘導(dǎo)液中培養(yǎng)一定時(shí)間后,通過(guò)茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成并定量分析。Westernblot結(jié)果顯示,OLCs中cdc42的表達(dá)在礦化誘導(dǎo)液的作用下未發(fā)生明顯改變,在LPS作用下明顯上調(diào)。茜素