Lis1-Dynein通路上中心體相關蛋白NudCL和Twa1的功能研究.pdf

1、細胞質Dynein是一類能與微管結合馬達蛋白，是細胞內(nèi)物質運輸?shù)闹饕寗恿χ弧Ｄ壳坝凶C據(jù)顯示無腦回綜合癥致病基因Lisl（Lissencephaly1）可能參與了Dynein運動能力的調節(jié)。在曲霉菌中，細胞核分布基因nudC（nuclear distribuTiO2gene C）可能是Lisl的同源基因nudF（nuclear distribuTiO2 gene F)的上游基因，nudC突變將極大降低NudF的蛋白水平。這樣，NudC

2、、Lisl和Dynein（其重鏈是細胞核分布基因nudA的同源基因）等組成了一條從曲霉菌到哺乳類進化上非常保守的調節(jié)通路。
　　 在哺乳動物中，Lisl/Dynein通路更加復雜化和網(wǎng)絡化。NudC和Lisl各自存在其同源物，協(xié)同這兩個蛋白共同發(fā)揮作用。這些蛋白和Dynein形成巨大的復合物，共同參與細胞內(nèi)物質運輸、細胞周期和細胞遷移的調控。同時，這條通路上的蛋白大都定位于中心體或沿著微管分布。而中心體作為微管組織中心影響了細胞

3、內(nèi)絕大多數(shù)與微管相關的過程，包括細胞有絲分裂、胞質分裂、細胞內(nèi)物質轉運和細胞遷移。因此，Lisl/Dynein通路的重要性越來越被人們所廣泛認識。但是，目前在這條通路中還有一些成員沒有被發(fā)現(xiàn)，而且已發(fā)現(xiàn)的蛋白之間的相互作用的具體機制也并不完全清楚。近年來我們實驗室一直從事這條通路上新成員的鑒定以及相互調控機制的研究。在這里我們重點研究了Lisl/Dynein通路中的兩個新成員：NudC同源蛋白NudCL（Nuclear distribu

4、TiO2 gene C Like)和Lisl相關蛋白Twal（Two hybrid associated protein No.1 with RanBPM），并首次觀察到了這兩個蛋白都定位于中心體上。為了進一步明確NudCL和Twal的生物學功能，闡明Lisl/Dynein通路的分子調控機制，我們從細胞水平和模式動物胚胎發(fā)育的角度來系統(tǒng)研究這兩個蛋白的功能。
　　 第一部分：中心體相關蛋白NudCL在細胞胞質分裂及細胞增殖中的作

5、用
　　 我們實驗室先前的工作發(fā)現(xiàn)NudCL在高爾基體上有定位，并能通過調節(jié)Dynein中間鏈（Dynein Intermediate Chain，DIC）的穩(wěn)定性影響細胞有絲分裂的正常進行。這里，我們通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)NudCL蛋白在細胞間期定位于中心體上，在有絲分裂中期富集在紡錘體的雙極（spindle poles），在胞質分裂期則集中到中體部位（midbody）。細胞計數(shù)和MTT實驗顯示在哺乳類細胞中過量表達NudCL可

6、以抑制細胞增殖。免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)NudCL過量表達會導致細胞出現(xiàn)多核現(xiàn)象。實時顯微攝影技術結合免疫熒光技術顯示，過量表達NudCL后大部分多核細胞的胞質分裂出現(xiàn)異常，主要表現(xiàn)為中體處微管結構的紊亂或中體環(huán)的消失。此外，NudCL過量表達還能引起細胞有絲分裂期時間延長，多極紡錘體的出現(xiàn)和染色體分向兩極的滯后等一些有絲分裂過程中的異常現(xiàn)象。通過RNAi實驗降低NudCL的表達水平我們還發(fā)現(xiàn)除了之前已經(jīng)報道的導致有絲分裂中期染色體排列異常、出

7、現(xiàn)啞鈴形細胞核、導致細胞死亡等一些現(xiàn)象以外，在一些越過M期阻滯的細胞中也出現(xiàn)胞質分裂的異常。這些結果提示NudCL可能除了前期發(fā)現(xiàn)的在有絲分裂中期的作用外，在胞質分裂期對中體結構的正確形成和兩個子代細胞之間連接的剪斷可能都有重要的意義。
　　 第二部分：中心體相關蛋白Twal在細胞遷移和胚胎發(fā)育中的作用
　　 無腦回綜合癥致病基因Lisl是一個在神經(jīng)細胞遷移、細胞增殖和存活等過程中扮演重要角色的基因。在小鼠中剔除Lisl

8、基因，小鼠在胚胎發(fā)育早期即死亡。人類的Lisl基因突變會導致I型無腦回綜合癥（Lissencephaly），患者大腦皮層平滑，智力低下，壽命短，常有癲癇發(fā)作。然而，至今為止尚無LIS1家族成員的報道。我們通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)了在進化上高度保守的Twal是一個具有Lisl同源結構域（LisH結構域）和LisH羧基端結構域（CTLH結構域）蛋白質。已有報道表明Twal在細胞核中有定位，并能和RanBPM（Ran-binding prot

9、ein M）和Muskelin相互作用，但其功能一直不明。我們的研究發(fā)現(xiàn)Twal除了定位于細胞核里外，在中心體上也有明顯定位，能在體內(nèi)與Lisl/Dynein相結合。愈傷實驗和Transwell實驗顯示，在細胞中降低Twal的蛋白水平會導致細胞遷移受阻。進一步研究發(fā)現(xiàn)Twal被降調的細胞在了leading edge處的Dynein分布缺失。此外過量表達缺失LisH功能結構域的Twal突變體也會導致細胞遷移受阻。RT-PCR半定量分析和原

10、位雜交顯示，在爪蟾胚胎發(fā)育過程中Twal在原腸形成時期（第10-13期）和器官形成時期（第19-30期）表達量較高；并且其表達主要集中在胚胎頭部，特別是眼部和腦部。在爪蟾胚胎中顯微注射缺失LisH功能結構域的Twal突變體質粒會導致胚胎頭部發(fā)育嚴重畸形，嚴重時會導致死亡。這些結果提示Twal可能與Lisl有部分類似的功能，能參與細胞遷移過程，并在胚胎早期發(fā)育，特別是腦和眼部發(fā)育中起重要作用。
　　 以上研究表明，Lisl/Dyn