過氧化物酶體增殖物激活受體-γmRNA和血清脂聯(lián)素與川崎病冠脈損傷的關(guān)系探討.pdf

1、研究背景：
　　川崎病（Kawasaki disease，KD）又稱皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征,是一種主要發(fā)生于兒童的非特異性全身性血管炎疾病。主要臨床特征為發(fā)熱、雙側(cè)球結(jié)膜充血、口腔黏膜炎癥、頸部淋巴結(jié)腫大、皮疹、手足硬腫、紅細胞沉降率增快、C反應(yīng)蛋白增高、血小板增高等,可累及心血管系統(tǒng),特別是冠狀動脈,發(fā)生率可達20％～25%，其中5%～10%的冠狀動脈病變可發(fā)展為缺血性心臟病。目前在一些較發(fā)達川崎病已超過風(fēng)濕熱成為兒童后天性心臟病

2、的最常見病因。
　　自1967年首次報道后，本病至今病因未明,發(fā)病機制尚不明確。目前多數(shù)學(xué)者認為KD是一種感染或超抗原觸發(fā)的超免疫反應(yīng)，造成內(nèi)皮細胞和其他細胞損傷,從而形成全身性血管炎。近期研究顯示過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（Peroxisome proliferator-activated receptorγ）和脂聯(lián)素（adiponectin，ADP）具有保護血管內(nèi)皮和抗炎等作用，并提示可能與冠狀動脈損傷的形成與發(fā)展有關(guān)。<

3、br>　　過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）屬于核內(nèi)受體超家族，有三種亞型：PPARα、PPARβ/δ及PPARγ，近年研究證實，PPARs的三種亞型也可在血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和單核/巨噬細胞等細胞中表達。具有多種生物效應(yīng)，在脂肪細胞分化、能量代謝、糖代謝、脂代謝、動脈粥樣硬化形成、炎性反應(yīng)及抑制腫瘤細胞等起重要作用。PPARγ其生物學(xué)功效主要和炎癥，血管內(nèi)皮細胞與平滑肌纖維細胞增殖、遷移等密切相關(guān)。PPARγ配基有天然配

4、基和合成配基2類，天然配基如前列腺素、多不飽和脂肪酸；合成配基如胰島素增敏劑TZDs類藥物，非類固醇類抗炎藥如阿司匹林、布洛芬等。激活后的PPARγ受體能抑制巨噬細胞表達炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α、白介素-6、白介素-1等。在缺血性心臟病初期，PPARγ調(diào)控、活化促炎細胞因子釋放。PPARγ激動劑可劑量依賴性抑制內(nèi)皮細胞的增殖，進而抑制內(nèi)皮細胞的遷移,部分阻斷血管內(nèi)皮生長因子表達細胞粘附分子，阻礙單核細胞和內(nèi)皮細胞的結(jié)合，從而限制血管

5、壁的炎癥，保護血管內(nèi)皮免受損傷。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)，缺血性心臟病患者中外周血PPAR-γ表達較正常者明顯減低，且降低的水平與缺血的程度呈負相關(guān)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)KD患兒在急性期、恢復(fù)期外周血PPARγmRNA高度表達，同時指出PPARγmRNA在KD患兒高度表達對早期動脈粥樣硬化的發(fā)展具有重要的臨床意義。
　　脂聯(lián)素亦稱Acrp30、AdipoQ或GBP28，是由脂肪細胞分泌的一種激素蛋白。脂聯(lián)素的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由244個氨基酸組成，分為

6、氨基末端的信號膚、中間的膠原樣結(jié)構(gòu)域、梭基末端的球形結(jié)構(gòu)域3個部分，具有增強胰島素敏感性、抗炎、心血管保護作用等多種生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在KD急性期，血清脂聯(lián)素明顯下降，同時發(fā)現(xiàn)受損血管內(nèi)皮細胞處有脂聯(lián)素聚集。KD急性期合并冠狀動脈損傷新生血管內(nèi)皮都有血管內(nèi)皮粘附因子-1表達，而脂聯(lián)素可明顯抑制血管內(nèi)皮粘附因-1的表達和炎性細胞向血管壁遷移過程，產(chǎn)生應(yīng)激保護作用；另外KD急性期冠狀動脈損害時腫瘤壞死因子-α等炎癥因子顯著增高，而脂聯(lián)素

7、與補體Clq、腫瘤壞死因子-α有共同的氨基酸序列，其能減少脂多糖刺激后的腫瘤壞死因子-α和白介素-6的釋放，抑制TNF-α誘導(dǎo)NF-κB抑制蛋白（Inhibitor ofκB，IκB）的降解，阻止NF-κB的激活，發(fā)揮其抗炎作用；脂聯(lián)素還可與不同血管內(nèi)皮細胞（主動脈內(nèi)皮細胞和臍靜脈等）上脂聯(lián)素受體1結(jié)合，促進一氧化碳釋放，對血管產(chǎn)生活性調(diào)節(jié)作用。用羅格列酮（PPARγ激動劑）喂養(yǎng)動物模型后，脂聯(lián)素表達及循環(huán)中血清脂聯(lián)素水平可明顯升高，提

8、示PPARγ激動劑可能通過直接或間接影響脂聯(lián)素表達和分泌。
　　研究目的：
　　通過檢測川崎病患兒PPARγmRNA表達、血清脂聯(lián)素、血脂、C反應(yīng)蛋白、血沉、血小板水平，探討PPARγmRNA和脂聯(lián)素在川崎病冠脈損傷中的作用。
　　方法：
　　1、對象選擇2011年10月至2013年7月在我院住院及門診隨訪的KD患兒45例，男30例、女15例，男：女=2：l,年齡2個月~6歲,平均(1.9±1.54)歲，其中1歲

9、以下13例(28.9％)，l歲~3歲15例(33.3％)，3歲~以上20例(44.4％)。均符合2002年日本KD研究委員會修訂第5版診斷標準，并排除其它疾?。痪础秾嵱脙嚎茖W(xué)》進行臨床分期；所有患兒入院后行心臟超聲檢查，按《實用兒科學(xué)》冠狀動脈受累程度分級分期標準，分為冠脈損害組(CAL)18例，均為輕度冠脈擴張，冠脈正常組(NCAL)27例。所有患兒于發(fā)病10天內(nèi)靜脈注射丙種球蛋白（IVIG）1-2g/kg治療，并予阿司匹林口服，劑

10、量30～50mg/kg·d，分三次，熱退2周左右減量至3~5mg/kg·d，維持6~8周，如有冠脈病變，用藥至冠脈恢復(fù)正常后一個月。選取其中32例檢測PPARγmRNA表達水平，女11例，男21例，年齡3月～4.6歲，平均年齡（1.75±1.02）歲。
　　選同時間段在我院門診體檢的健康兒童20例為正常對照組，男14例、女6例，男：女=2.3：l，年齡4個月~6歲，平均(1.99±1.34)歲。各組間年齡（F=0.537, P=0

11、.958）、性別（χ2=0.07, P=0.965）無顯著性差異。
　　2、標本采集 KD組分別于急性期(發(fā)熱7天內(nèi))、治療后亞急性期（發(fā)熱8-21天）及恢復(fù)期（發(fā)熱21~30天）清晨空腹采血：①取2ml于干燥管內(nèi)，離心后收集血清，采用美國美國Beckman公司生產(chǎn)的Unicel DXC8000 PRO全自動生化測定儀測定血脂七項：包括三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、載脂

12、蛋白A(APOA)、載脂蛋白B(APOB)、脂蛋白(LPA)，剩余血清分裝于-80℃超低溫冰箱保存，用于ADPN檢測。②取1ml加入EDTA-Na2抗凝管，充分搖勻，美國Beckman公司全自動血液分析儀檢測血小板、CRP；取250ul抗凝血加入到750ul的TRIzol中，用于提取RNA。③取2ml加入肝素鈉抗凝管，采用魏氏法檢測血沉。
　　3、實驗方法
　　3.1 RT-qPCR檢測全血PPARγmRNA的表達采取TRI

13、ZOL法提全血中總RNA，以RNA為模板，應(yīng)用RT試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用ABI7300實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增（實驗操作按照說明書進行）。應(yīng)用ABI7300系統(tǒng)軟件分析進行結(jié)果分析。
　　3.2 雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法測定ADP濃度。
　　4、統(tǒng)計學(xué)處理統(tǒng)計分析采用SPSS13.0軟件，所有計量資料數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，采用 X±S表示，組間均數(shù)比較用t檢驗，非正態(tài)分布采用

14、Kruskal-Wallis秩和檢驗；多組間的比較采用單因素方差（analysis of variance,ANOVA）分析，兩兩比較方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnett’T3檢驗。相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)分析，非正態(tài)分布采用Spearman相關(guān)分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、32例KD患兒外周血PPAR-γmRNA表達水平急性期(3.29±2.67)、亞急性期(2.60±2.

15、26)、恢復(fù)期(2.12±1.90)三期均高于對照組(1.05±0.56)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);KD急性期組PPAR-γmRNA分別和亞急性期組、恢復(fù)期比較有明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。KD患兒非冠脈擴張組（NCAL組，22例）外周血PPAR-γmRNA表達水平在急性期(4.58±2.20 vs.0.45±0.43)、亞急性期(3.56±2.08 vs.0.48±0.47)、恢復(fù)期(2.68±2.01 vs

16、.0.89±0.75)三期均高于冠脈擴張組（CAL組，10例），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、急性期,45例KD組較正常組血清ADP(5.21±2.30μg/ml vs.9.05±2.01μg/ml), TC(3.21±0.77mmol/L vs.4.16±0.25mmol/L)、HDL_C(0.63±0.16mmol/L vs.1.04±0.14mmol/L)、LDL_C(2.02±0.73mmol/L vs.2.

17、61±0.37mmol/L)、APOA(0.84±0.22g/Lvs.1.22±0.10g/L)and APOB(0.84±0.22g/Lvs.0.96±0.10g/L)均降低， P=0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00；亞急性期,KD組較正常組血清ADP(5.79±2.29μg/ml vs.9.05±2.01μg/ml), HDL_C(0.81±0.17mmol/L vs.1.04±0.14mmol/L)均降低，

18、 P=0.00、0.00,KD組較正常組血清 TG(1.48±0.78mmol/L vs.1.06±0.14mmol/L)增高， P=0.00；恢復(fù)期,KD組較正常組血清ADP(7.73±2.36μg/ml vs.9.05±2.01μg/ml),APOB(0.81±0.19g/Lvs.0.96±0.10g/L)均降低，P=0.03、0.00,KD組較正常組血清APOA(1.41±0.26g/Lvs.1.22±0.10g/L)增高，P=0

19、.00；
　　3、急性期NCAL組(27例)較CAL組(18例)血清ADP(4.53±1.83μg/ml vs.6.22±2.61μg/ml)降低， P=0.01；亞急性期NCAL組較CAL組血清TG(1.69±0.92mmol/L vs.1.17±0.32mmol/L)增高，P=0.01；恢復(fù)性期NCAL組較CAL組血清ADP(4.53±1.83μg/ml vs.6.22±2.61μg/ml)降低, P=0.03；血清TG(1.

20、05±0.52mmol/L vs.0.70±0.20mmol/L)增高，P=0.00。
　　4、KD患兒外周血PPARγmRNA與PLT、ADP呈明顯負相關(guān)，r值分別為（-0.45，-0.34），P值分別為（0.00,0.05）；與冠脈損傷呈明顯正相關(guān)，r=0.80,P=0.00;與年齡、性別、CRP、ESR無相關(guān)性。
　　5、KD患兒血清ADPN與CRP呈明顯正相關(guān)，r=0.40,P=0.03;與冠脈損傷呈明顯負相關(guān)，r=

21、-0.34,P=0.05;與年齡、性別、PLT、ESR無相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1、KD患兒在急性期、亞急性期、恢復(fù)期外周血中PPAR-γmRNA表達水平明顯增高，非冠脈擴張組在急性期、亞急性期、恢復(fù)期較冠脈擴張組均有明顯增高。
　　2、KD患兒血清 ADPN在急性期、亞急性期、恢復(fù)期均有顯著降低。CAL組血清ADPN水平比NCAL組不同病程比較均有增高，在急性期與恢復(fù)期比較有顯著增高。
　　3、KD患兒在不同

22、病程中均存在脂類代謝紊亂。KD患兒急性期HDL-C、Apo A、TC、Apo B水平顯著下降，在隨后的亞急性期HDL-C仍有顯著下降，Apo B恢復(fù)期仍有下降，其它至恢復(fù)期逐漸正常；而TG亞急性期水平顯著升高，Apo A恢復(fù)期時明顯升高; L D L-C及LPA無明顯改變。CAL組血清TG水平在亞急性期、恢復(fù)期比NCAL組顯著降低，而在急性期無顯著差異。
　　4、KD患兒外周血PPARγmRNA與血清ADPN、PLT、呈明顯負相關(guān)