SRT1720激活SIRT1抑制軟骨細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【研究目的】
　　骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)又稱退行性關(guān)節(jié)炎，是一種由于關(guān)節(jié)軟骨退行性病變引起的關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)功能障礙（包括關(guān)節(jié)畸形）的中老年常見疾病。曾經(jīng)一度認(rèn)為關(guān)節(jié)軟骨的改變是骨關(guān)節(jié)炎主要的病變，但現(xiàn)在普遍認(rèn)為，所有關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)包括軟骨鈣化區(qū)、軟骨下骨、骨小梁、關(guān)節(jié)囊等都受到影響。然而，OA的具體發(fā)病機(jī)制現(xiàn)在還沒有完全明確，且其治療也是一個(gè)棘手的問題。臨床治療方法很多，但迄今還沒有一種治療方法能有效阻斷骨關(guān)節(jié)

2、炎的病理進(jìn)程，而對(duì)于后期治療采用的關(guān)節(jié)置換術(shù)存在費(fèi)用大、風(fēng)險(xiǎn)性高、假體容易出現(xiàn)問題等。
　　目前在OA的基因治療方面，國(guó)際上還處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，但是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡在OA軟骨退變發(fā)生發(fā)展中的作用如何，以及藥物調(diào)控某個(gè)或多個(gè)基因治療OA的療效如何，是一個(gè)值得深入研究的課題。由于骨關(guān)節(jié)炎是一種衰老相關(guān)性疾病，同時(shí)SIRT1基因在抗衰老方面具有的重要作用已引起人們高度關(guān)注，因此本項(xiàng)目以SIRT1作為靶點(diǎn)研究其對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制。

3、通過采用新型藥物SRT1720啟動(dòng)SIRT1，研究對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，進(jìn)一步闡明OA發(fā)生發(fā)展中SIRT1的作用，為防治OA提供新的靶位；與此同時(shí)研究新型藥物SRT1720對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響，為藥物防治OA開辟一條新的途徑。
　　【實(shí)驗(yàn)方法】
　　一、軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)
　　新西蘭大白兔（2月齡）麻醉，取其雙膝股骨髁及脛骨平臺(tái)軟骨，放入盛有DMEM高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。PBS沖洗數(shù)次后，剪切軟骨至1mm3大小的碎塊

4、。加入酶消化，然后離心，將分離的細(xì)胞均勻分布于培養(yǎng)基中。
　　二、分組加入藥物后誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡
　　1．按不同SRT1720濃度分組：
　　2．硝普鈉(SNP)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡：1h后在培養(yǎng)體系中分別加入0.25mmol／L SNP，孵育12h。
　　三、相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)
　　1．MTT法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞活性及增殖
　　2．DAPI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡
　　3．western-blot

5、技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞Sirt1、p53、NF-κB、bax、PGC-1α的表達(dá)
　　4．RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞Sirt1、Ⅱ型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖mRNA的表達(dá)
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
　　1．MTT法示：隨著SRT1720濃度增高，細(xì)胞活性依次增強(qiáng)。
　　2．DAPI染色示：SRT1720干預(yù)組的軟骨細(xì)胞核形完整、染色質(zhì)均勻；而對(duì)照組軟骨細(xì)胞可見核破裂形成碎片，核解體。
　　3．流式細(xì)胞術(shù)示：隨著SRT172

6、0濃度增高，細(xì)胞凋亡率依次降低。
　　4．western-blot示：隨著SRT1720濃度增高，細(xì)胞Sirt1、PGC-1α的表達(dá)依次增高，而p53、NF-κB、bax的表達(dá)依次降低。
　　5．RT-PCR示：隨著SRT1720濃度增高，細(xì)胞Sirt1、Ⅱ型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖mRNA的表達(dá)依次增高。
　　【結(jié)論】
　　1．SRT1720能啟動(dòng)Sirt1基因使其對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用,抑制軟骨細(xì)胞凋亡。這