弓形蟲中國分離株毒力相關(guān)的發(fā)病機(jī)制：巨噬細(xì)胞極化引起ICR孕鼠不良妊娠結(jié)局.pdf

1、目的:弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,可以寄生于所有溫血?jiǎng)游锇ㄈ祟?。孕期感染弓形蟲可導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和胎兒畸形,弓形蟲可經(jīng)胎盤垂直傳播導(dǎo)致新生兒先天性弓形蟲病,影響其出生后的生長發(fā)育和智力水平[1]。歐洲和北美的弓形蟲主要有三個(gè)克隆系譜(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型)。最近研究顯示,小鼠巨噬細(xì)胞感染Ⅰ型和Ⅲ型蟲株后宿主的巨噬細(xì)胞亞型向M2極化;而感染了Ⅱ型蟲株的巨噬細(xì)胞則向類似于M1的方向極化。蟲體所分泌的毒力相關(guān)因子等可以不依賴于模式識別受

2、體來誘導(dǎo)M1或M2的極化。宿主在孕期主要是Th2應(yīng)答占優(yōu)勢的免疫環(huán)境,對于本室分離的兩個(gè)分離株,TgCtwh3和TgCtwh6,它們有著相同的基因型,卻有著不同的毒力。本研究探討了孕期感染上述兩個(gè)蟲株后,小鼠體內(nèi)M1/M2和Th1/Th2應(yīng)答的偏移及其差異,巨噬細(xì)胞極化方向,相同基因型不同毒力蟲株誘導(dǎo)不良妊娠結(jié)局及其相關(guān)機(jī)制。本文旨在為基因型相關(guān)的先天性弓形蟲病的防治提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:體內(nèi)試驗(yàn):將ICR小鼠以雌雄2:

3、1的比例合籠,得到90只孕鼠,隨機(jī)分為三組:TgCtwh3組、TgCtwh6組和對照組。于孕第8天( G8)TgCtwh3組和TgCtwh6組分別腹腔注射0.1ml生理鹽水含200個(gè)速殖子;對照組只注射等量生理鹽水。分別于妊娠第10、12、14、16、18天麻醉下頸椎脫臼處死小鼠,取腹腔巨噬細(xì)胞和胎盤。同一組的部分胎盤4％甲醛固定,石蠟包埋,HE染色和TUNEL檢測;部分胎盤用熒光定量PCR做蟲荷定量。巨噬細(xì)胞上清檢測尿素和 NO;用W

4、estern-blotting檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOs和Arg-1的蛋白水平;流式檢測巨噬細(xì)胞表面CD206、MHCⅡ、PDL-2、CD80、CD86、PDL-1的水平。取G14天的三組動(dòng)物脾臟,流式檢測CD4+IFN-γ和CD4+IL-4的百分比。
　　體外實(shí)驗(yàn):孕鼠于孕12~14天無菌操作取胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,Transwell共培養(yǎng),速殖子與巨噬細(xì)胞按照1:1比例分別感染 TgCtwh3和 TgCtwh6蟲株,另設(shè)一組無

5、感染對照。各組分別于2h、6h、12h、24h收集上清和巨噬細(xì)胞,滋養(yǎng)層細(xì)胞固定做 TUNEL檢測。巨噬細(xì)胞上清檢測IL-10、IL-23、IL-12的水平;巨噬細(xì)胞內(nèi)的蛋白檢測同體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:1、三組小鼠的胎盤隨著妊娠天數(shù)的增加凋亡率上升,依次為TgCtwh3組。TgCtwh6組大于對照組。
　　2、HE染色結(jié)果顯示,與TgCtwh3組和對照組相比,TgCtwh6感染組胎盤局部在感染早期出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤;TgC

6、twh6蟲株感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在孕14天開始出現(xiàn)高水平的 NO,而其他兩組未能檢測到 NO分泌;脾臟淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果提示,TgCtwh6感染組 PDL-1、CD80、CD86表達(dá)明顯增高。
　　3、TgCtwh3蟲株感染組 Arg-1水平高于 TgCtwh6組和對照組;孕14天的小鼠TgCtwh3感染后腹腔巨噬細(xì)胞 CD206、PDL-2和MHC-Ⅱ表達(dá)明顯增高;脾臟細(xì)胞流式檢測結(jié)果顯示,與對照組和TgCtwh6組相

7、比,TgCtwh3組更趨向Th2應(yīng)答的偏移。
　　4、體外實(shí)驗(yàn)中,Transwell共培養(yǎng)2h、6h、12h、24h的巨噬細(xì)胞上清中,TgCtwh3感染組的各時(shí)間點(diǎn)上清均出現(xiàn)高水平的尿素(urea),提示精氨酸酶(arginase)的活性較高;而TgCtwh6感染小鼠的上清液略比對照組稍有增高;TUNEL檢測結(jié)果顯示,胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡率TgCtwh6組>TgCtwh3組>對照組;TgCtwh6組巨噬細(xì)胞的上清中M1型細(xì)胞因子的水平

8、高于其他兩組。
　　結(jié)論:采用相同基因型Chinese1的不同毒力蟲株,毒力較強(qiáng)的TgCtwh3蟲株和毒力較弱的TgCtwh6蟲株感染孕鼠都導(dǎo)致了不良妊娠結(jié)局。TgCtwh3蟲株感染的孕鼠巨噬細(xì)胞向 M2型偏移,致體內(nèi)免疫應(yīng)答類型更偏向于Th2型,結(jié)果可能使得弓形蟲速殖子大量繁殖,破壞宿主細(xì)胞,直接或間接導(dǎo)致誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡率增加;而弱毒TgCtwh6組蟲株感染后,孕鼠巨噬細(xì)胞向M1型偏移,分泌的M1型細(xì)胞因子可能改變孕鼠Th2