胸腺上皮腫瘤預后影響因素分析及DNA甲基化失衡的實驗研究.pdf

1、胸腺上皮腫瘤是前縱隔常見的腫瘤之一，其在生物學、腫瘤學和組織學上特性極為復雜，病理分型和分期一直是近年來外科學和病理學領域極具爭議的難題之一。Masaoka病理分期根據術中和鏡下腫瘤侵犯范圍對胸腺上皮腫瘤進行分期，被認為是判斷疾病預后的有效指標之一。但由于該方法沒有考慮組織學因素，因而存在一定局限性。1999年WHO推行的胸腺上皮腫瘤組織學分型標準，按照淋巴細胞/上皮細胞比例和上皮細胞形態(tài)將胸腺上皮腫瘤分為：A型、AB型、B1型、B2型

2、、B3型和C型，從組織病理學角度對胸腺上皮腫瘤進行較為詳細的分類，為疾病診斷和預后判斷提供了較好的組織病理學標準。盡管目前在胸腺上皮腫瘤的病理分型、分期、診斷和治療方法研究方面取得了一定進展，但對于其具體的發(fā)病分子機理仍不清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤當中某些腫瘤抑制基因失活，但其DNA序列完整，并未有突變、缺失等變化，用經典的遺傳調控理論難以解釋其失活的現(xiàn)象，因而逐漸認識到表觀遺傳調控在腫瘤發(fā)生和發(fā)展當中的作用。表觀遺傳調控主要包括DNA甲

3、基化和組蛋白修飾，其中DNA甲基化是目前表觀遺傳學領域研究的熱點。近年來研究認為DNA甲基化是腫瘤抑制基因失活的主要原因之一，在某些情況下甚至可能為調控基因轉錄的唯一的機制。研究認為腫瘤發(fā)生時腫瘤抑制基因啟動子區(qū)高甲基化失活的同時，通常伴隨有基因組DNA整體的低甲基化和DNA甲基化轉移酶的高表達，這三種異常的甲基化狀態(tài)被稱為“甲基化失衡”。目前在肺癌、結腸癌、口腔粘膜上皮癌中均觀察到這種典型改變，但在胸腺上皮腫瘤中仍缺乏相應報道。為此，

4、我們第一部分根據胸腺上皮腫瘤病例臨床、病理和隨訪資料，進行統(tǒng)計學分析，尋找胸腺上皮腫瘤預后相關因素；第二部分首先采用實時定量RT-PCR技術檢測胸腺上皮腫瘤中腫瘤抑制基因mRNA表達情況，再采用巢式MSP技術檢測其啟動子區(qū)甲基化情況，并與臨床病理資料進行分析；采用免疫組織化學法和ELISA法檢測胸腺上皮腫瘤石蠟標本和新鮮組織標本中基因組DNA總體甲基化情況，探討其與臨床病理之間的關系；最后采用實時定量RT-PCR技術檢測DNA甲基化轉移

5、酶mRNA表達情況，并與臨床病理資料進行分析，系統(tǒng)觀察胸腺上皮腫瘤中DNA甲基化失衡情況，以期進一步探討與疾病相關的發(fā)病機制和可能的生物學標志物。 第一部分胸腺上皮腫瘤病理分型分期及預后影響因素分析 目的：通過對胸腺上皮腫瘤患者臨床、病理及隨訪資料進行分析，探尋與疾病預后相關的影響因素。 方法：本院心胸外科1997年6月至2007年9月胸腺上皮腫瘤病例137例，記錄患者臨床資料、病理記錄，并于術后進行隨訪。應用K

6、aplan-Meier法、COX回歸模型進行生存分析并判斷疾病預后影響因素。 結論：Masaoka病理分期，WHO組織學分型，腫瘤完全切除及手術時患者年齡是胸腺上皮腫瘤患者重要的預后相關因素。 第二部分胸腺上皮腫瘤中DNA甲基化失衡狀態(tài)的實驗研究 第一節(jié)胸腺上皮腫瘤中腫瘤抑制基因表達失活及啟動子區(qū)甲基化情況研究 目的：觀察多種腫瘤抑制基因在胸腺上皮腫瘤中表達情況，并檢測其啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)，探討胸腺

7、上皮腫瘤中腫瘤抑制基因失活的可能機制。 結論：胸腺上皮腫瘤中存在多種腫瘤抑制基因mRNA表達下調，啟動子區(qū)高甲基化可能是其失活的重要機制，且這一過程與WHO組織學分型和Masaoka病理分期密切相關。 第二節(jié)胸腺上皮腫瘤中基因組DNA總體甲基化改變及其臨床意義的研究 目的：檢測胸腺上皮腫瘤細胞中基因組DNA總體甲基化水平，并分析其與臨床病理資料間的關系，探尋基因組DNA總體甲基化狀態(tài)與胸腺上皮腫瘤發(fā)生的關系。

8、 方法：采用實時定量RT-PCR技術從mRNA水平檢測胸腺上皮腫瘤組織中腫瘤抑制基因APC1A，RAR β，E-cad，hMLH1，RASSF1A，F(xiàn)HIT，P16INK4a，MGMT和DAPK表達情況；采用巢式MSP技術檢測胸腺上皮腫瘤組織中多種腫瘤抑制基因啟動子區(qū)甲基化情況，并分析其與臨床病理參數之間的關系。 結果：按照Masaoka病理分期，腫瘤早期（Ⅰ/Ⅱ期）5-MC染色明顯高于晚期（Ⅲ/Ⅳ期）病例（p<0.01）。

9、按照WHO組織學分型，腫瘤上皮細胞分化越差，其5-MC染色越淺。我們分別對比了A、AB、B1、B2、B3和C型六種亞型間染色差異，并參考組織病理學將A和AB型歸為A組，B1、B2和B3型歸為B組，C型作為C組，比較三組之間的染色差異；最后按照A/AB/B1組和B2/B3/C組比較染色差異。結果發(fā)現(xiàn)AB型與B1型之間5-MC染色無明顯差異（p=0.455），B3型與C型之間5-MC染色無明顯差異（p=0.779），其余各亞型之間染色差異均

10、具有統(tǒng)計學意義。按照A、B和C三組，三組之間5-MC染色均具有明顯差異（A和B，p<0.01；A和C，p<0.01；B和C，p<0.01）。按照A/AB/B1組和B2/B3/C組，B2/B3/C組5-MC染色明顯低于A/AB/B1組（p<0.01）。ELISA法檢測新鮮組織中基因組DNA甲基化情況與石蠟標本結果相似?；蚪MDNA總體甲基化情況與性別和合并MG無明顯關系。 結論：在胸腺上皮腫瘤細胞當中基因組DNA總體甲基化水平低下

11、，隨著腫瘤惡性程度的增高和腫瘤的進展，基因組DNA總體甲基化程度越來越低，且與WHO組織學分型和Masaoka病理分期關系密切。 第三節(jié)胸腺上皮腫瘤中DNA甲基化轉移酶表達及其臨床意義的研究 目的：觀察DNA甲基化轉移酶（DNMT）在胸腺上皮腫瘤中表達情況，并與臨床病理資料進行分析，探討DNA甲基化轉移酶在胸腺上皮腫瘤異常甲基化過程中的作用。 方法：采用實時定量RT-PCR技術從mRNA水平檢測胸腺上皮腫瘤組織中