索拉非尼聯(lián)合放射抗肝細胞癌效應(yīng)的實驗研究.pdf

1、第一部分索拉非尼聯(lián)合放射抗肝細胞癌的體外研究
　　目的:索拉非尼的多激酶抑制作用提示其與放射聯(lián)合有協(xié)同增效的潛在可能。本部分研究旨在通過兩種人肝癌細胞株（SMMC-7721，SK-HEP-1）來觀察索拉非尼與放射聯(lián)合是否對肝癌有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)以及可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的聯(lián)合方式。方法:通過CCK-8法細胞毒性增殖實驗繪制不同濃度索拉非尼處理48h后的肝癌細胞存活曲線，計算索拉非尼對肝癌細胞的抑制濃度(IC)。選擇IC50（抑制細胞生長5

2、0％時的藥物濃度）的10％作為克隆形成實驗的藥物濃度。通過克隆形成實驗比較索拉非尼在γ線照射前/后處理與單純放射后的肝癌細胞劑量效應(yīng)曲線，計算放射增敏比。
　　結(jié)果:SMMC-7721和SK-HEP-1細胞的IC50分別是4.82μM和9.55μM。故選用10％的IC50，即0.5μM和1μM分別作為兩種肝癌細胞克隆形成實驗的藥物濃度。索拉非尼對兩種肝癌細胞株的放射敏感性改變因索拉非尼與放射聯(lián)合方式的不同而異。索拉非尼后處理(R-

3、＞S)明顯增加了SMMC-7721細胞的放射敏感性(SER=1.21)，但幾乎不改變SK-HEP-1細胞的存活曲線斜率(SER=1.00)。索拉非尼預(yù)處理(S+R)則使兩種肝癌細胞的存活曲線在較高照射劑量區(qū)域的斜率都出現(xiàn)明顯增加（β值增加），SMMC-7721和SK-HEP-1的SER分別是1.10和1.18。
　　結(jié)論:體外實驗發(fā)現(xiàn)了索拉非尼與放射聯(lián)合對兩種不同放射敏感性的肝癌細胞產(chǎn)生不同程度的放射增敏效應(yīng)。
　　第二部分

4、索拉非尼對肝癌細胞放射增敏效應(yīng)的機制研究
　　目的:本部分研究旨在從細胞增殖、DNA損傷及修復、細胞凋亡等多個可能影響放射敏感性的方面，來闡述索拉非尼與放射聯(lián)合在肝癌細胞中產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的潛在機制。
　　方法:通過Western blot方法檢測索拉非尼聯(lián)合放射作用于肝癌細胞對放射所誘導的細胞增殖(p-ERK1/2)、DNA損傷修復(p-Ku70、p-BRCA1)、細胞凋亡(p-NF-KB)和新生血管形成(p-VEG FR2)

5、等多個方面的蛋白表達水平的調(diào)控。通過微核實驗考察索拉非尼是否增加了放射所誘導的DNA損傷。通過AnnexinⅤ/PI流式細胞術(shù)和caspase-3酶活性檢測，觀察索拉非尼對放射所誘導細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:索拉非尼與放射聯(lián)合作用于肝癌細胞可以有效地抑制由放射誘導的VEGFR2磷酸化及其下游信號傳導通路中ERK的激活。索拉非尼與放射聯(lián)合較單純放射在肝癌細胞中增加了細胞微核率、同時又抑制雙鏈斷裂HR和NHEJ修復途徑的關(guān)鍵蛋白BR

6、CA1和Ku70的磷酸化表達。此外，放射所誘發(fā)的NF-KB磷酸化激活可以被索拉非尼的聯(lián)合應(yīng)用所抑制，索拉非尼也顯著增加了放射后早期凋亡細胞比例和caspase-3酶活性。然而，SK-HEP-1細胞索拉非尼在放射后給藥組在以上作用機制中均有所例外，這也正解釋了這一組沒有產(chǎn)生放射增敏的結(jié)果。
　　結(jié)論:索拉非尼與放射聯(lián)用于肝癌細胞，可以抑制放射后細胞增殖，增加放射引起的DNA損傷并抑制兩種關(guān)鍵途徑的DNA修復能力，同時促進放射誘導的凋

7、亡。以上多種機制共同促成了索拉非尼對肝癌細胞的放射增敏作用。
　　第三部分索拉非尼聯(lián)合放射抗肝癌效應(yīng)的體內(nèi)研究
　　目的:本部分實驗研究旨在觀察索拉非尼與放射聯(lián)合在肝癌荷瘤裸鼠模型中的抗腫瘤效應(yīng)。
　　方法:通過皮下接種SMMC-7721和SK-HEP-1細胞建立肝癌的荷瘤裸鼠模型。對移植瘤進行以下分組處理:對照組、單純放射組、放射序貫聯(lián)合索拉非尼組以及索拉非尼同步聯(lián)合放射組。其中，索拉非尼給藥分為高劑量(100mg/

8、kg/d)和低劑量(30 mg/kg/d)。構(gòu)建不同處理組不同劑量點的腫瘤生長曲線，并用Gompertz模型或Cubic模型進行擬合。以移植瘤生長達到2倍初始體積(VO)為目標效應(yīng)，計算各處理組的腫瘤生長延遲天數(shù)(TGD)并用相應(yīng)的對照組進行標化。根據(jù)不同的放射劑量和標化的TGD產(chǎn)生劑量效應(yīng)曲線，計算劑量修飾因子(DMF)。
　　結(jié)果:對于5MMC-7721移植瘤，放射后序貫聯(lián)合索拉非尼延遲腫瘤生長的作用具有劑量依賴性，即隨著索拉

9、非尼劑量加大而增加（DMF最大可達1.57）;但是，索拉非尼同步聯(lián)合放射在兩種索拉非尼劑量水平產(chǎn)生相似的腫瘤生長延遲作用（DMF為1.4左右）。對于SK-HEP-1移植瘤，索拉非尼同步聯(lián)合放射產(chǎn)生藥物劑量依賴性的生長抑制作用（DMF最大可達1.82）;而放射后序貫聯(lián)合索拉非尼也增加了放射的效應(yīng)，但其延遲腫瘤生長的作用不隨索拉非尼劑量的增加而增加（DMF為1.5左右）。
　　結(jié)論:索拉非尼與放射聯(lián)合在肝癌移植瘤中可產(chǎn)生顯著的放射增敏